2013
—2014年湖北省外环境中禽流感病毒污染情况分析

刘琳琳，叶国军，江永忠，方斌，李翔，肖红雨，李国明

湖北省疾病预防控制中心，武汉 430079

·论著·

2013
—2014年湖北省外环境中禽流感病毒污染情况分析

刘琳琳，叶国军，江永忠，方斌，李翔，肖红雨，李国明

湖北省疾病预防控制中心，武汉 430079

摘要：为了解2013—2014 年湖北省外环境中禽流感病毒污染情况，采用实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)对全省7个监测点1 642份活禽相关外环境标本进行禽流感病毒型别与阳性率监测。结果显示，2013—2014年湖北省外环境中禽流感病毒平均阳性检出率为19.1%，检出的禽流感病毒型别以H9亚型为主(占57.3%)，未检出H7亚型。不同地区和季节禽流感病毒阳性率有所差异，鄂西北冬春季病毒检出阳性率高于鄂西南和江汉平原；家禽屠宰加工厂检出阳性率最高；阳性率最高的标本来自清洗禽类的污水。结果提示，湖北地区外环境中禽流感病毒阳性率较高，且型别多样，家禽屠宰加工人员对禽流感病毒有较高的暴露风险，需加强健康宣教，提高个人防护意识。

关键词：禽流感；外环境；污染

禽流感(avian influenza)是由A型流感病毒的任何一个亚型引起各种家禽及野生禽类感染或发生疫病的一种传染性疾病[1]，人禽流感是人接触禽流感病毒感染动物的排泄物或分泌物并出现以呼吸道感染、黏膜充血等症状为主要表现的人禽共患病[2]。我国自2004 年初开始报告动物禽流感疫情，2005 年10月湖南省报告了中国大陆首例人禽流感确诊病例[3]，2006年4月及2010年6月湖北省分别确诊一例人感染高致病性禽流感病例[4-5]。2013年3月30日我国确诊3例人感染H7N9禽流感病例，为全球首次发现人感染H7N9禽流感病毒[6]。2013—2014年我国人感染H7N9禽流感情况严重，至2014年6月4日中国内地共确诊433例，死亡163例。病例分布在14个省市，报告病例数前5位省市为浙江、广东、江苏、上海、湖南[7]。湖北省H7N9 禽流感发病率处于全国前列，但2013—2014 年期间未发生人感染H7N9禽流感病例。湖北省处于水网区域，且活禽市场、禽类养殖场繁多，自然环境和人群生活习惯亦为人与家禽及野生禽类接触提供了更多机会，因此存在人禽流感疫情发生和蔓延的危险因素。本研究对湖北省2013—2014 年外环境中禽流感病毒污染状况进行研究，评估湖北省禽流感疫情发生风险，为当地疫情防控提供依据。

1材料与方法

1.1监测点设置

根据湖北省各城市以往人间与禽间禽流感发生情况及地理位置，选择东南、西北及湖网地区的荆州、十堰、宜昌、襄阳、鄂州、随州、武汉共7个城市作为监测城市，每个监测点选取城乡活禽市场、家禽规模养殖场(户)、家禽散养户集中区、家禽屠宰加工厂及野生候鸟栖息地作为监测场所。

1.2标本采集

每月在每个监测点采集外环境监测标本，包括监测点内的水样、禽类(含候鸟)粪便及笼具表面擦拭物。标本采集使用北京友康科技有限公司的病毒采样管。采集环境样本时，用随管配备的医用棉拭子涂抹禽类笼具内壁、笼具中或养殖场地面新鲜粪便、宰杀和摆放禽肉的砧板表面或处理禽类的污物桶和褪毛机等，然后将棉拭子放入含采样液的螺旋管内。2013及2014年分别采集外环境标本811份和831份。

1.3外环境标本核酸检测

由中国国家流感中心提供H5、H7、H9型禽流感病毒引物和探针序列，具体见表1。

表1本研究所用引物

Tab.1Primers used in the study

Primer/probe Sequence H5-Forward5'-TGGAAAGTRTAARAAACGGAACGT-3'H5-Reverse5'-YGCTAGGGARCTCGCCACTG-3'H5-Probe5'-TACCCGCAGTATTCAGAAGAAGC-BHQ1-3'H7-Forward5'-AGAAATGAAATGGCTCCTGTCAA-3'H7-Reverse5'-GGTTTTTTCTTGTATTTTTATATGACTTAG-3'H7-Probe5'-FAM-AGATAATGCTGCATTCCCGCAGATG-BHQ1-3'H9-Forward5'-CAAGCTGGAATCTGARGGAACTTACA-3'H9-Reverse5'-GCATCTGCAAGATCCATTGGACAT-3'H9-Probe5'-CCCAGAACARGAAGGCAGCAAACCCCATTG-BHQ1-3'

采用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)对外环境标本进行禽流感病毒核酸检测。所用仪器为PCR仪(ABI 7300，273003117)、核酸自动提取仪(西安天隆科技有限公司，NP968，TL101211230)。试剂为病毒RNA提取试剂盒(西安天隆科技有限公司)、实时PCR 检测试剂盒(Allen-Bradley公司，货号4387391)。配制反应体系：2×RT-PCR Buffer 12.5 μL、25×RT-PCR Enzyme Mix 1 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、探针0.5 μL、RNase Free Water 5 μL，加双蒸水至20 μL。将上述反应液混匀，分装到0.2 mL PCR小管中，每管20 μL，分别做好标记。将分装好的PCR小管加入模板，首先加入阴性对照管(5 μL无菌水)，然后分别加入标本RNA(每管5 μL)，最后加入阳性对照RNA(每管5 μL)。混匀，短暂离心后放入PCR仪进行RT-PCR扩增：45 ℃ 10 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s， 40个循环；60 ℃ 45 s， 40个循环。

循环阈值(cycle threshold, Ct)≤35的标本直接判定为阳性；对于Ct值在35～40的可疑标本，需通过实时RT-PCR扩增曲线、扩增Ct值、平行重复样本和阴阳性对照品等综合判定(当可疑标本和平行重复标本Ct值均在35～40且均具有“S”形扩增曲线时判定为阳性，否则为阴性)； Ct值>40的标本判定为阴性。

1.4统计学分析

用SPSS 11.0软件进行统计分析，采用χ2检验比较组间病毒检测阳性率差异。

2结果

2.1湖北省2013 和2014年禽流感病毒监测结果

2013年采集外环境标本811份，禽流感病毒核酸阳性136份，总阳性率为16.8%。其中H9阳性52份，占38.2%；H5阳性8份，占5.9%；其他亚型(FluA阳性且H5、H7、H9阴性)58份，占42.6%；H5和H9混合阳性18份，占13.2%；无H7阳性标本。2014年采集外环境标本831份，禽流感病毒核酸阳性178份，总阳性率为21.4%。其中H9阳性128份，占71.9%；H5阳性6份，占3.4%；其他亚型阳性35份，占19.7%；H5和H9混合阳性9份，占5.0%；无H7阳性标本，但H7 阳性对照标本均为RT-PCR 阳性。

2.2湖北省不同区域监测点禽流感病毒检测结果

2013年设武汉、荆州、十堰、襄阳、鄂州、宜昌共6个城市为禽流感病毒监测点。其中武汉、荆州、十堰、襄阳监测点均检测到禽流感病毒，阳性率为6.6%～43.4%，以襄阳监测点检出率最高(59，43.4%)，荆州最低(9，6.6%)(表2)。然而，鄂州和宜昌采集的各120份标本均未检出病毒核酸。

2014年在上述6 个城市的基础上增加了随州为禽流感病毒监测点。检测结果显示，除宜昌外，其他6个城市监测点所采集的标本禽流感病毒核酸阳性率为9.0%～28.1%，以襄阳监测点检出率最高(50，28.1%)，荆州最低(16，9.0%)(表2)。

表2湖北不同区域外环境标本禽流感病毒监测结果

Tab.2Avian influenza virus in external environment in different districts in Hubei

YearCityPositivesampleTotalH5H7H9H5+H9Others2013Ezhou0(0)0(0)0(0)0(0)0(0)0(0)Jingzhou9(6.6%)3(2.2%)0(0)0(0)0(0)6(4.4%)Shiyan31(22.8%)0(0)0(0)21(15.4%)9(6.6%)1(0.7%)Wuhan37(27.2%)1(0.7%)0(0)20(14.7%)7(5.1%)9(6.6%)Xiangyang59(43.4%)4(2.9%)0(0)11(8.1%)2(1.5%)42(30.9%)Yichang0(0)0(0)0(0)0(0)0(0)0(0)2014Ezhou30(16.9%)0(0)0(0)30(16.9%)0(0)0(0)Jingzhou16(9.0%)0(0)0(0)7(3.9%)0(0)9(5.1%)Shiyan40(22.5%)0(0)0(0)32(18.0%)5(2.8%)3(1.7%)Wuhan17(9.6%)1(0.6%)0(0)6(3.4%)1(0.6%)9(5.1%)Xiangyang50(28.1%)5(2.8%)0(0)28(15.7%)3(1.7%)14(7.9%)Yichang0(0)0(0)0(0)0(0)0(0)0(0)Suizhou25(14.0%)0(0)0(0)25(14.0%)0(0)0(0)Total314(19.1%)14(0.9%)0(0)180(11.0%)27(1.6%)93(5.7%)

2.3不同季度标本禽流感病毒检测结果

进而分析不同季度标本禽流感病毒检测情况。2013年4个季度禽流感病毒检测的阳性率分别为11.6%、14.2%、14.0%、27.4%，各季度间标本阳性率差异有统计学意义(χ2=23.480，P<0.01)。2014年4个季度禽流感病毒检测的阳性率分别为12.0%、19.3%、26.3%、25.9%，各季度间标本阳性率差异有统计学意义(χ2=14.472，P<0.01)(表3)。结果提示，秋冬季禽流感活动水平较高。

表3不同季度外环境标本禽流感病毒监测结果

Tab.3Avian influenza virus in external environment in different seasons

YearSeasonSamplePositiverate(%)SubtypeH5H7H9H5+H9Others2013119811.60(0)0(0)3(13.0%)2(8.7%)18(78.3%)219714.20(0)0(0)10(35.7%)6(21.4%)12(42.9%)321514.03(10.0%)0(0)16(53.3%)4(13.3%)7(23.3%)420127.45(9.1%)0(0)23(41.8%)6(10.9%)21(38.2%)2014117512.04(19.0%)0(0)6(28.6%)3(14.3%)8(38.1%)221219.31(2.4%)0(0)27(65.9%)2(4.9%)11(26.8%)322826.30(0.0%)0(0)51(85.0%)1(1.7%)8(13.3%)421625.91(1.8%)0(0)44(78.6%)3(5.4%)8(14.3%)Total164219.114(4.5%)0(0)180(57.3%)27(8.6%)93(29.6%)

2.4不同标本类型禽流感病毒检测结果

2013及2014年外环境标本有6种，分别为禽类(含候鸟)粪便标本、笼具表面擦拭标本、禽类饮水标本、清洗禽类的污水标本、宰杀和摆放禽肉的砧板拭子标本及处理禽类的污物桶和褪毛机。每种标本检出的禽流感病毒阳性率不同(图1～2)，差异均有统计学意义(χ2=99.740，P<0.01；χ2=153.737，P<0.01)。检出阳性率最高的标本来自清洗禽类的污水，构成比最高的病毒型别为H9型，未检出H7型禽流感病毒。

2.5不同监测场所禽流感病毒检测结果

2013年除家禽规模养殖场(户)和野生候鸟栖息地外，其余3类监测场所均检出禽流感病毒。其中以家禽屠宰加工厂阳性率最高，为44.9%，而家禽散养户集中地区为8.6%，各监测场所之间阳性率差异有统计学意义(χ2=144.138，P<0.01)。2014年除家禽散养户集中地区和野生候鸟栖息地外，其余3类监测场所均检出禽流感病毒。仍以家禽屠宰加工厂阳性率最高，为55.0%，家禽规模养殖场(户)阳性率最低，为1.2%，各监测场所之间阳性率差异有统计学意义(χ2=171.084，P<0.01)。详见表4、图3、图4。

图12013年禽流感病毒型别构成比及各标本类型阳性率

Fig.1The constituent ratio of avian influenza viruses and positive rate of various samples in 2013

图22014年禽流感病毒型别构成比及各标本类型阳性率

Fig.2The constituent ratio of avian influenza viruses and positive rate of various samples in 2014

表4不同监测场所外环境禽流感病毒监测结果

Tab.4Avian influenza virus in external environment in different monitoring points

Monitoringpoint2013SamplePositivesample2014SamplePositivesampleLivepoultrymarket364102(28.0%)398131(32.9%)Poultryfarm2730(0)2553(1.2%)Concentratedareaoffree-rangepoultry353(8.6%)320(0.0%)Poultrydressingplant6931(44.9%)8044(55.0%)Migratorybirdhabitat700(0)660(0)Total811136(16.8%)831178(21.4%)

图32013 年各监测场所禽流感病毒检出阳性率

Fig.3The positive rate of avian influenza virus in various monitoring points in 2013

图42014年各监测场所禽流感病毒检出阳性率

Fig.4The positive rate of avian influenza virus in various monitoring points in 2014

3讨论

本研究显示，湖北省2013—2014年禽流感病毒在外环境中的阳性率为19.1%，在不同地区、季节、标本类型和监测场所中均以H9亚型禽流感病毒为主，在两年的监测中未检出H7亚型禽流感病毒，与湖北省2013—2014 年未发生人感染H7N9相符合。通过研究发现，鄂西北的襄阳、随州、十堰病毒检出率较高，而鄂西南及江汉平原的宜昌、荆州病毒检出率很低甚至为零，提示禽流感病毒在湖北省分布不均。虽然禽流感病毒在全年均能检测到，但不同季度病毒检出率有差异。总体而言，秋冬季病毒阳性率为全年最高。各地应针对本地禽流感病毒时空分布情况进行防控策略制定。通过对涉禽环境的病毒监测，本研究发现家禽屠宰加工厂环境中禽流感病毒阳性最高，阳性率最高的标本来自清洗禽类的污水，提示从事禽类屠宰加工为危险度较高的暴露方式，外环境中(特别是禽类零售摊点)存在人禽流感病毒污染，是导致人禽流感散发病例不时出现的原因。有研究表明，在越南2004年开始出现H5N1人禽流感病例之前，H5N1禽流感病毒已在市场外环境中存在超过3年。因此，加强活禽市场的管理和消毒依然是防止或减少人禽流感散发病例的关键。在野生候鸟栖息地未检出禽流感病毒，可能与野鸟活动范围大、采样时间和采样点选择及标本数量少等有关。检出的病毒类型除常见的H5、H9亚型及两者混合型别外，还有很大比例(29.6%)为其他型别，这与国内其他报道相一致[8-9]。2014年以来，湖北省周边省份均发现人感染禽流感新型病毒，如江西省人感染H10N8禽流感病毒[10]、广东省人感染H5N6禽流感病毒[11]，且在患者生活的外环境中溯源到相关病毒，均提示外环境中禽流感病毒是人类感染的源头。2015年以来，湖南省和江苏省等地禽类养殖场暴发H5N6高致病性禽流感疫情[12]，中国台湾地区首次出现全球新型H5N2高致病性禽流感，河南省和山西省等地还发生候鸟野鸭因H5N1高致病性禽流感死亡事件，加之国内活禽交易市场间活禽往来频繁，增加了外环境中禽流感病毒交叉污染和暴露的风险，需引起特别关注。

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Avian influenza viruses in environmental samples collected in Hubei Province, 2013-2014

LIU Linlin, YE Guojun, JIANG Yongzhong, FANG Bin, LI Xiang, XIAO Hongyu, LI Guoming

Hubei Provincial Center for Disease Control and Prevention, Wuhan 430079, China

Abstract:To investigate the situation of environmental pollution by avian influenza virus in Hubei Province, 2013-2014, 1 642 live-bird related environmental samples collected from 7 monitoring points were detected by real-time polymerase chain reaction (PCR). The virus types and positive rates were analyzed. The results showed that the positive rates of avian influenza virus in 2013 and 2014 were 16.8% and 21.4%, respectively. The leading virus subtype was H9 (57.3%). H7 avian influenza virus was not detected. The positive rates in different areas and seasons were different. The positive rate of northwest in Hubei Province was higher than that of southeast and Jianghan Plain. The poultry dressing plant had the highest detection rate. The sample with highest positive rate was from poultry cleaning wastewater. The results suggest that the environment of Hubei Province has high detection rate of avian influenza virus, with various types. The people who work in poultry dressing plants have higher risk. Therefore health education should be strengthened to enhance the personal protection consciousness.

Key words:Avian influenza; External environment; Pollution

通信作者：李国明

Corresponding author. LI Guoming, E-mail: liguominghb@163.com

(收稿日期：2015-05-15)