6种常用低聚糖对嗜热链球菌体外生长的影响

夏晓风，王虎飞，吴晓玉*（1.江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌330045；2.南昌市发酵应用技术重点实验室，江西南昌330045）

6种常用低聚糖对嗜热链球菌体外生长的影响

夏晓风1，2，王虎飞1，2，吴晓玉*1，2
（1.江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌330045；2.南昌市发酵应用技术重点实验室，江西南昌330045）

为使低聚糖和嗜热链球菌在生产中能合理配伍使用，并为益生菌产品的开发提供理论依据，采用6种常用低聚糖分别替代M17培养基中部分或全部乳糖组分，以及添加不同浓度低聚糖到M17作为发酵培养基这两种方法，研究6种低聚糖对嗜热链球菌生长以及产酸性能的影响。结果表明，6种低聚糖替代乳糖可造成嗜热链球菌生长能力下降甚至停止生长，而在乳糖存在的情况下，添加低聚糖有利于菌株的生长及产酸。

低聚糖；嗜热链球菌；生长；乳酸；高效液相色谱

嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）是乳酸菌的一种，是仅次于乳酸乳球菌的第二大重要的商业菌种［1］。它属于化能异养型微生物，不能合成多种有机化合物，必须从外界吸收多种小分子营养物质才能较好实现自身的新陈代谢。S.thermophilus之所以成为重要的商业菌种在于其发酵产生大量的有机酸（如乳酸、甲酸、乙酸）、醇、醛、酮和氨基酸等代谢物质，这些物质相互作用形成了发酵产品特有的风味［2-5］，是主要的乳品发酵剂之一。S. thermophilus以单一或复合制剂用于青贮饲料时，可以提高畜禽对饲料的利用率，促进畜禽生长，降低畜禽死亡率［6-7］。该菌可大量产生乳酸等有机酸，降低肠道pH，抑制病原菌和肠内腐败菌的生长，激活宿主的巨噬细胞和免疫细胞，同时显著降低血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇含量［8］。另外，嗜热链球菌具有β-乳糖酶，能缓解乳糖不耐受性，具有部分抑制肿瘤的能力［3］。

研究表明，功能性低聚糖具有多种生理功能，可通过促进肠道益生菌的生长和抑制病原菌的生长来调节肠道菌群平衡，降低血脂血压和血清胆固醇，促进营养物质（如矿物质）的消化吸收，增强机体免疫功能等［9］。低聚糖同时具有用量小、增殖效果显著等特性，故少许添加量就能达到良好的生理功能。目前广泛应用于食品、医药、保健品，以及饲料工业［10-11］。虽然低聚糖和嗜热链球菌对人体和动物均具有明显的益生作用，但至目前，就6种常用低聚糖对嗜热链球菌生长影响的研究少有报道。因此，本文拟阐述6种常用低聚糖对嗜热链球菌生长的影响，以期为低聚糖和嗜热链球菌在生产中的配伍使用以及益生菌产品的开发提供科学依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种Streptococcus thermophilus（嗜热链球菌），购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.1.26种低聚糖种类低聚异麦芽糖（质量分数99%）、低聚果糖（质量分数99%）、低聚乳糖（质量分数95%）、低聚半乳糖（质量分数99%）、低聚木糖（质量分数99%）和乳酮糖（质量分数99%），购自河南金源生物科技有限公司。

1.1.3培养基M17培养基（改良培养基，g/L）：胰蛋白胨5，鱼蛋白胨5，牛肉膏5，酵母浸膏2.5，抗坏血酸0.5，硫酸镁0.25，甘油10，磷酸二氢钾5，乳糖3；pH 7.0。详见文献［12］。

1.2方法

1.2.1菌种母液的制备取5支处于对数生长期的嗜热链球菌斜面，用M17培养基洗下，调节A600= 1.000±0.050，待用。

1.2.2低聚糖替代M17培养基的乳糖对S. thermophilus生长影响的测定低聚糖分别按照25%、50%、100%的替换量部分或完全替代基础培养基中的乳糖，制成替代培养基A1。取菌种母液（A600=1.000±0.05）按体积分数1%的接种量接种于培养基A1，42℃静置培养，分别取培养4、12、24、36、48 h菌液，测定各菌液中嗜热链球菌A600值和pH值，每个处理设3个重复，并以接种于M17培养基和接种于不含乳糖组分的M17培养基的菌液为对照组。

1.2.3M17培养基中添加低聚糖对S.thermophilus生长影响的测定低聚糖按照0.05、0.1、0.25 g/dL 和0.5 g/dL 4种不同质量浓度添加到M17培养基中，制成添加培养基A2。取菌种母液（A600=1.000± 0.05）按体积分数1%的接种量接种于培养基A2，42℃静置培养，分别取培养4、12、24、36、48 h菌液，测定各菌液中嗜热链球菌A600值和pH值，每个处理设3个重复，并以接种于M17培养基的为对照组。

1.2.4高效液相色谱法测定菌液中乳酸和乙酸含量菌液前处理：取由实验1.2.2和1.2.3确定的对嗜热链球菌生长促进作用较好的最适低聚糖添加量，42℃静置培养，分别取培养0、4、12、24、36、48 h的菌液，离心，取上清液，用0.22 μm微孔滤膜过滤两次，稀释2.5倍，待测。色谱条件：色谱柱Aminex Hpx-87H柱，流动相0.002 mol/L H2SO4，体积流量0.6 mL/min，柱温35℃，检测波长210 nm，进样量15 μL。

2　结果与分析

2.1低聚糖替代M17培养基的乳糖组分对S. thermophilus生长的影响

由图2可知，路径3，即深圳港-江门水上“巴士”，具有不可替代的优势.相比路径1在运输成本、时间和服务水平上均占有绝对优势，这主要因为江门新会与深圳港的水上距离更近，且深圳港可为货主提供更好的服务.虽然路径3的运输成本高于路径2，但其规模运输避免了多次往返，节约了运输时间使得经济性较好.故深圳港-江门新会水上“巴士”的优势明显，短时间内不会货源流失.

2.1.16种低聚糖对S.thermophilus生长量的影响按照1.2.2研究低聚糖替代M17培养基的乳糖对S. thermophilus生长的影响，结果如图1所示：6种低聚糖部分或完全取代乳糖时，S.thermophiluss的生长量均有不同程度的降低，且均随着低聚糖替代乳糖比例的增大，生长量降低的幅度越大。其中低聚乳糖完全替代乳糖（100%替代乳糖）时，该菌生长量在整个生长过程中（0～48 h）没有变化，说明其生长被抑制，而低聚果糖、低聚半乳糖与低聚木糖完全替代乳糖时，生长量变化迟缓，菌株生长缓慢。无糖组嗜热链球菌在整个培养过程中完全不生长。

图1　6种低聚糖对嗜热链球菌菌液A600值的影响（替代实验）Fig.1　Effects of six oligosaccharides on growth of S. thermophiluss（replacement test）

2.1.2低聚糖替代M17培养基乳糖组分对S. thermophiluss发酵液pH值的影响按照1.2.2测定培养0、4、12、24、36、48 h菌液的pH值，设置M17培养基的发酵液为对照组，见图2。结果表明，低聚糖替代乳糖的比例越大，随培养时间的延长，发酵液pH下降幅度越小；尤其低聚乳糖、低聚半乳糖、低聚果糖以及低聚木糖在完全替代乳糖时，与初始pH值比较，培养48 h后pH下降幅度不明显。图2显示，发酵液pH值均在培养12 h时有一个转折点。培养0～12 h时，pH值下降幅度较大，12 h以后下降幅度减缓，pH值变化不明显。与图1相比较，发酵液pH值的变化规律与菌量的变化规律存在相关性，表明菌量大小影响发酵液产酸量，从而影响pH值的变化。无糖组嗜热链球菌发酵液pH在整个培养过程中与初始pH相比几乎无变化。

图2　6种低聚糖对嗜热链球菌菌液pH的影响（替代实验）Fig.2　Effects of six oligosaccharides on solution pH of S. thermophiluss（replacement test）

2.2M17培养基中添加低聚糖对S.thermophilus生长的影响

2.2.1低聚糖不同添加量对S.thermophilus生长量的影响按照1.2.3，M17培养基中添加低聚糖对S.thermophilus生长的影响如图3所示，结果表明，6种低聚糖作为添加因子按照不同质量浓度添加到M17培养基时，S.thermophilus的生长量均有不同程度的增加。其中，与对照组相比，低聚异麦芽糖、低聚果糖、低聚半乳糖和乳酮糖的添加量为0.5 g/dL时，S.thermophilus的生长量增加幅度最大。而低聚乳糖和低聚木糖则分别在0～0.1 g/dL和0～0.25 g/dL内随着添加量的增大，S.thermophilus的生长量增大，超过这个范围则生长迟缓。低聚乳糖最佳添加量为0.1 g/dL，低聚木糖为0.25 g/dL。

图3　6种低聚糖对嗜热链球菌菌液A600值的影响（添加实验）Fig.3　Effects of six oligosaccharides on growth of S. thermophiluss（adding test）

2.2.2低聚糖不同添加量对发酵液pH值的影响按照1.2.3测定培养0、4、12、24、36、48 h菌液的pH值，设置M17培养基的发酵液为对照组，见图4。结果表明，与对照组相比，实验组随着培养时间的延长，发酵液pH下降幅度增大。当低聚异麦芽糖、低聚果糖、低聚半乳糖和乳酮糖的添加量为0.5 g/dL时，S.thermophilus的发酵液pH与初始pH相比有较大幅度下降。而低聚乳糖和低聚木糖则分别在0～0.1 g/dL和0～0.25 g/dL范围内随着添加量的增大，发酵液pH下降，这与图3菌量的变化规律一致。由图4可以看出，培养12 h以后pH变化不明显。

图4　6种低聚糖对嗜热链球菌菌液pH的影响（添加实验）Fig.4　Effects of six oligosaccharides on solution pH of S. thermophiluss（adding test）

2.3添加低聚异麦芽糖和乳酮糖对发酵液乳酸和乙酸生成量的影响

在M17培养基中添加低聚异麦芽糖和乳酮糖后，菌株产乳酸和乙酸的能力均较对照组有不同程度的提高。其中添加低聚异麦芽糖的发酵液乳酸和乙酸含量高于添加乳酮糖的。菌株产乳酸水平在0～12 h内呈直线上升，培养12 h达最大值，以后趋于稳定；而乙酸含量则在0～36 h时呈上升趋势，36 h达最大值，之后，乙酸含量不断下降；且3个处理组均显示乙酸含量远低于乳酸含量，说明菌株主要通过同型乳酸发酵产生乳酸，使发酵液pH值下降。将图5（a）与菌株生长量的增长及发酵液pH值变化趋势（图3（e）（f）；图4（e）（f））相比较，其变化趋势相似度极高，均在12 h达到最大值，以后趋于稳定。推测菌株生长量的提高，造成发酵产乳酸总体能力增强，造成发酵液pH值下降。

图5　不同培养时间发酵液中乳酸和乙酸产量变化Fig.5　Changes of lactic acid and acetic acid content in the fermented solution within different culture time

图6　嗜热链球菌培养12 h发酵液的乳酸和乙酸色谱图Fig.6　Chromatogram of lactic acid and acetic acid from broth fermented for 12 h by S.thermophilus

3　讨论

低聚糖又称寡糖，是由2～10个相同的或不同的单糖单位通过糖苷键聚合而成的直链或分支的一类低度聚合糖，其相对分子质量约为300～2 000，分为普通低聚糖和功能性低聚糖两大类［14-16］。普通低聚糖（如蔗糖、麦芽糖、麦芽三糖、乳糖等）可以被机体消化吸收［17-18］。功能性低聚糖［19］（如水苏糖、棉子糖、异麦芽酮糖、乳酮糖、低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖、低聚乳果糖、低聚异麦芽糖和低聚异麦芽酮糖等）因在动物胃肠道没有水解这些糖类（除异麦芽酮糖之外）的酶系统，不被消化吸收而直接为益生菌所利用，因此可以作为益生菌的增殖因子［9，18，20-21］。

本课题的替代实验结果显示，当M17培养基中不含乳糖成分时，嗜热链球菌生长量及pH值变化趋于零，说明尽管培养基中存在其他可用碳源物质，但该菌株在无乳糖条件下几乎不生长。当6种低聚糖（低聚异麦芽糖、低聚果糖、低聚乳糖、低聚半乳糖、低聚木糖和乳酮糖）以不同比率替代乳糖作为碳源时，随着替代量的增大，嗜热链球菌的生长量降低、产酸能力减弱，且均低于乳糖为碳源时；当完全替代乳糖，替代糖为低聚乳糖、低聚半乳糖以及低聚木糖时，菌株几乎不生长或生长极其缓慢。表明以上述6种低聚糖为碳源，不利于S. thermophilus的生长与产酸。由添加实验可以看出，6种低聚糖中低乳酮糖作为促生因子，可以有效促进嗜热链球菌的生长、增强产酸能力；其次为低聚异麦芽糖、低聚半乳糖及低聚果糖，而低聚木糖、低聚乳糖的促生长作用效果不明显。通过高效液相色谱测定发酵液中乳酸和乙酸含量进一步证实：伴随S. thermophilus生长量增加，其产乳酸能力提高，引起发酵液pH值下降，且发酵液乳酸含量在菌量达到最大值（发酵培养12 h）时也同时达到最大值并趋于稳定。

据资料显示，大部分S.thermophilus菌株没有分解淀粉和大分子碳水化合物的酶系，不能利用大分子物质作碳源，仅能利用葡萄糖、乳糖、蔗糖等单糖和一些寡糖为碳源［4，22］。其中乳糖作为碳源生长率最高，其次为蔗糖，再次为葡萄糖与果糖，且菌株生长率低至易被代谢的乳糖、蔗糖的数分之一［23-24］。菌株在对糖类的吸收利用过程中，磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统（phosphoenolpyruvate-dependent sugar phosphotransferase system，简称PTS）是乳酸菌及其他细菌的主要糖吸收系统。但对于S. thermophilus，蔗糖和果糖是唯一可以由PTS吸收利用的糖［25-26］。乳糖则通过专用渗透酶LacS（Lactose/ H+同向转移或lactose/galactosetang交换）被吸收利用［27］。

4　结语

根据本课题的实验结果，6种低聚糖替代乳糖作为碳源，不利于S.thermophilus的生长与产酸，而在培养基中添加少量低聚糖（0.05～0.5 g/dL），如乳酮糖、低聚异麦芽糖、低聚半乳糖等，对其生长与产酸有明显或少量促进作用，推测该特性与S. thermophilus吸收、转化、利用低聚糖的能力有关，其受制于低聚糖的结构特征。有关低聚糖结构与S. thermophilus吸收利用的关系，有待进一步深入研究。

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Effects of Six Commonly Used Oligosaccharides on the Growth of Streptococcus thermophilus in vitro

XIA Xiaofeng1，2，WANG Hufei1，2，WU Xiaoyu*1，2
（1.School of Bioscience and Bioengineering，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China；2.Nanchang Key Laboratory of Fermentation Application Technology，Nanchang 330045，China）

The effect of six oligosaccharides on the growth of Streptococcus thermophilus and its capability of lactic acid production was investigated by two methods to provide a theoretical basis for the realization of the compatibility use of oligosaccharides and Streptococcus thermophilus for industry production and probiotic products development.One way is to partly or completely replace the lactose composition of M17 culture medium by six commonly used oligosaccharides.Another way is to add six oligosaccharides with various concentrations into M17 culture medium.Six oligosaccharides have been proved to cause a reduction in the growth of Streptococcus thermophilus or even cause growth stop if oligosaccharides completely replaced lactose，while the addition of oligosaccharides was conducive to the growth of Streptococcus thermophilus with the presence of lactose.

oligosaccharide，Streptococcus thermophilus，growth，lactic acid，HPLC

TS 24；TS 201

A

1673—1689（2016）03—0310—08

2014-11-25

农业部功能食品重点实验室开放基金项目（粤农科蚕加字【2012】9号）。

吴晓玉（1966—），女，江西南昌人，工学博士，教授，主要从事微生物开发利用研究。E-mail：xywu166@163.com