一株铜绿假单胞菌的分离鉴定与耐药性分析

赵建

（南阳医学高等专科学校基础医学部 河南南阳 473000）

一株铜绿假单胞菌的分离鉴定与耐药性分析

赵建

（南阳医学高等专科学校基础医学部 河南南阳 473000）

目的：对矽肺患者痰标本中分离到的菌株NY-7进行分离鉴定。方法：将菌株NY-7经形态观察，生化反应，16s rDNA鉴定后分析其耐药性。结果：经生化鉴定及16s rDNA鉴定所分离细菌NY-7为一株铜绿假单胞菌。结论：对病原菌进行有效鉴定，并分析其耐药性，对于临床防治疾病具有重要作用。

病原菌 16s rDNA鉴定 耐药性

抗菌药物因长期性、广泛性应用,且在应用过程中存在一定不合理性,导致菌株产生较为明显耐药性,因此了解病原菌特性及其耐用性对于临床用药具有重要作用［1］。本文NY-7进行分离鉴定,并分析其耐药性,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

从矽肺患者痰标本分离到的菌株NY-7。

1.2 方法

1.2.1 培养基

LB液体培养基：10 g 蛋白胨,5 g 酵母浸粉,5 g NaCl,18 g琼脂定容至1 L。高压湿热灭菌,121 ℃,20分钟。

麦康凯琼脂培养基：20g蛋白胨,5g牛胆盐,10g乳糖,0.03g中性红,5 g NaCl,18 g琼脂定容至1 L。

1.2.2 细菌形态鉴定

通过革兰氏染色和简单染色的方法观察细菌的大小、形态及其革兰氏反应类型。

1.2.3 生理生化检测

通过用质控菌株铜绿假单胞菌ATCC27853菌株做对照,依据伯杰氏细菌分类鉴定手册（9th edition）［2］中的方法进行蔗糖、水杨酸、D-木糖、硫化氢、乳糖、麦芽糖、L-阿拉伯糖、甘露醇、间-肌醇、尿素酶、七叶苷水解、葡萄糖、山梨醇、吲哚、M-R、V-P、枸橼酸盐利用、明胶液化等生化实验。

1.2.4 16S rDNA基因序列分析

用试剂盒提取菌株NY-7的DNA,将染色体DNA作为PCR扩增的摸板PCR扩增NY-7的16S rDNA基因。所用的引物是通用正向引物P1（5'-3'） AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和通用反向引物P2（5'-3'） GGTTACCTTGTT ACGACTT。

PCR反应条件：94℃,5min；94℃,3min；58℃,1min；72℃, 1min；72℃,3min。扩增产物直接进行测序,测序结果通过http：// www.ncbi.nih.nlm.gov网站进行BLAST序列比对。

对铜绿假单胞菌耐药性进行分析,自琼脂培养基挑选分离的铜绿假单胞菌,接种到M-H琼脂平板。将质控菌株铜绿假单胞菌ATCC27853作对照,分析药物敏感性,所选取药物为：青霉素、氨苄西林、哌拉西林、头孢曲松、头孢噻肟、头孢噻呋、亚胺培南、四环素、氨曲南、丁胺卡那、庆大霉素、氯霉素、妥布霉素、强力霉素、红霉素、环丙沙星、罗红霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、磷霉素等［3］。

2 结果

2.1 菌株NY-7的形态特性

NY-7在普通琼脂培养基上生长18～24h可以见到扁平、湿润的菌落,该菌产生的带荧光的水溶性色素使培养基呈亮绿色；在血琼脂平板上生长时可以见到在菌落的周围有溶血环,菌落呈金属光泽；革兰阴性菌,菌体的一端有单鞭毛,无芽胞。葡萄糖氧化分解、氧化酶、精氨酸双水解、乙酰胺酶、葡萄糖酸氧化、硝酸盐还原产氨试验均为阳性。根据《伯杰氏手册》将NY-7初步鉴定为铜绿假单胞菌。

2.2 16s rDNA 鉴定结果

PCR扩增的16S rDNA基因片段,NY-7的大小为1.4kb左右。登陆NCBI网站,16s rDNA序列比对结果表明,菌株NY-7与质控菌株铜绿假单胞菌ATCC27853具有99.9%的同源性。

2.3 菌株NY-7的药物敏感性试验

分离的铜绿假单胞菌NY-7对于氨苄西林、青霉素、红霉素、利福平、氯霉素高度耐药（R）,对于罗红霉素、四环素、头孢吡肟中度敏感（I）,对于磷霉素、亚胺培南、氧氟沙星、诺氟沙星、丁胺卡那高度敏感。药敏试验中各种药物对大肠杆菌的抑菌圈直径如表1所示。

表1 药敏试验中各药物对NY-7的抑菌圈直径（mm）

3 讨论

本论文通过进行形态观察、生理生化实验、16S rDNA核酸序列将来自矽肺患者痰标本中分离到的菌株NY-7鉴定为铜绿假单胞菌。NY-7在普通琼脂培养基培养菌落扁平、湿润,产生绿色带荧光的水溶性色素；在血琼脂平板上生长时可以见到在菌落的周围有溶血环,菌落呈金属光泽；革兰阴性菌,菌体的一端有单鞭毛,无芽胞；葡萄糖氧化分解、氧化酶、精氨酸双水解、乙酰胺酶、葡萄糖酸氧化、硝酸盐还原产氨试验均为阳性通过16s rDNA 测序后表明NY-7的 16s rDNA 序列与质控菌株铜绿假单胞菌ATCC27853同源性为99.9%,因此确定NY-7为铜绿假单胞菌。NY-7对于氨苄西林、青霉素、红霉素、利福平、氯霉素高度耐药（R）,对于罗红霉素、四环素、头孢吡肟中度敏感（I）,对于磷霉素、亚胺培南、氧氟沙星、诺氟沙星、丁胺卡那高度敏感。由于广谱抗生素的广泛使用,铜绿假单胞菌对多种抗生素快速产生耐药性,这就使得临床的抗感染治疗显得越来越困难。因此,临床上还应加强消毒防御,合理地科学地使用抗生素,并应在药敏试验结果指导下进行抗感染治疗［4］。

［1］ 刘奕.655例铜绿假单胞菌的分布及耐药性分析［J］.国际检验医学杂志，2010，31（11）： 1308-1310.

［2］ 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册［M］.第1版.北京东黄城北街16号：科学出版社，2001，64-65.

［3］胡锡仙，张特.ICU肺部感染的病原菌分布及药敏分析［J］.中华医院感染学杂志，2013，23（10）：2472-2474.

［4］隋素琴，尤兆雄，张瑞君.医院感染病原菌的分布及耐药性分析［J］.中华医院感染学杂志，2012，22（20）：4639-4641.

Q93

A

1674-2060（2016）03-0320-01

赵建（1974—），女 ，讲师。