响应面法优化南海鸢乌贼墨汁多糖提取工艺

杨丽芝,杨贤庆,黄　卉,李来好,邓建朝,赵永强,杨少玲

(1.中国水产科学研究院南海水产研究所,农业部水产品加工重点实验室,国家水产品加工技术研发中心,广东广州 510300;2.上海海洋大学食品学院,上海 201306)



响应面法优化南海鸢乌贼墨汁多糖提取工艺

杨丽芝1,2,杨贤庆1,*,黄卉1,李来好1,邓建朝1,赵永强1,杨少玲1

(1.中国水产科学研究院南海水产研究所,农业部水产品加工重点实验室,国家水产品加工技术研发中心,广东广州 510300;2.上海海洋大学食品学院,上海 201306)

目的:为探索南海鸢乌贼墨汁多糖的最佳提取工艺,利用响应面分析法对南海鸢乌贼墨汁多糖提取工艺进行优化。方法:在单因素实验基础上选取因素与水平,根据中心组合实验设计原理采用三因素三水平的响应面分析法,以获得多元二次线性回归方程,以Y(多糖含量(%)×粗多糖得率(%)×104)为响应值分析各因素的交互作用。结果:鸢乌贼墨汁多糖提取的最佳工艺条件:料液比1∶2、浸提液pH5.5、加酶量1.00%,此条件下,粗多糖得率为0.91%,多糖含量为9.8%,与理论预测值接近。结论:采用响应面法优化鸢乌贼墨多糖提取工艺,取得最佳提取工艺,且具有可行性。

鸢乌贼,墨汁多糖,提取,响应面分析

鸢乌贼(Sthenoteuthisoualaniensis)柔鱼科,鸢乌贼属,体型与常见鱿鱼相似,广泛分布于印度洋和太平洋的热带、亚热带海域,其中以南海海域数量较大[1-3]。冯波等人根据克里金插值法估算得,南海鸢乌贼资源量为204.94万t,总可捕量为99.40万t,是一种极具开发潜力的资源[4]。乌贼墨是当乌贼遇到天敌时,喷出的一种用来防身的物质,主要由黑色素和蛋白多糖复合体组成,近年来,国内外对乌贼加工副产物墨汁做了一系列研究,研究表明乌贼墨汁不仅具有抗肿瘤[5-7]、抗辐射[8]、止血[9]等多种生理功能,还可以抗衰老、抗氧化和增强机体免疫力[10]等。天然产物多糖具有诸多生物活性,在抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、免疫调节和降血糖等方面表现出良好的应用前景,且来源广泛无毒,近年来成为研究的热点[11],国内外研究者从乌贼墨中分离出墨多糖并对其活性进行研究,发现墨多糖具有抗氧化[12]、抗菌、防腐保鲜、抑制肿瘤细胞生长繁殖等功能[13]。多糖提取方法很多,传统提取法有水提醇沉法、酸碱法等,但得率较低,操作较复杂,随着技术研究的深入,酶法微波辅助提取法、超声提取法、超高压提取法、膜分离技术逐渐代替了传统的提取方法,乐小炎[14]等采用超声波结合酶法提取乌贼墨多糖,超声波处理与木瓜蛋白酶水解结合,乙醇沉淀后得到粗多糖,并进一步分离纯化得到一种含3%硫酸根的多糖。

响应面法能够通过建立多元二次回归数学模型,从而达到优化提取工艺参数的目的,具有周期短、精度高、且能够研究几种因素之间的交互作用等优点,是一种合理的实验设计方案。目前,虽然对糖的研究逐步深入,但是南海鸢乌贼加工副产物墨汁多糖的提取暂未见报道,为得到较佳的鸢乌贼墨汁多糖提取工艺,本实验利用水提醇沉结合木瓜蛋白酶酶解的方法,在单因素的基础上,以Y(多糖含量(%)×粗多糖得率(%)×104)为测定指标,采用响应面法优化料液比、浸提pH及加酶量,进而优化提取条件,提高粗多糖得率,为南海鸢乌贼墨多糖的提取分离提供更经济、更简单的技术方法,为进一步充分开发利用鸢乌贼资源提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

新鲜鸢乌贼南海水产研究所科考船“南锋号”于2014年7月份捕捞于南海海域,取墨囊,挤出墨汁,将墨汁混匀,冻藏冰箱,备用;木瓜蛋白酶6000 U·mg-1,上海楷阳生物;无水乙醇、氯仿、正丁醇、苯酚、浓硫酸、无水葡萄糖均为分析纯。

AvantiJ26XP 高速离心机美国;UV2550紫外可见分光光度计、EYELAN-1000旋转蒸发仪日本。

1.2实验方法

1.2.1南海鸢乌贼墨多糖提取工艺流程取50 g鸢乌贼墨汁,加一定量蒸馏水,调节pH,40 ℃热水浸提4 h,4 ℃浸提12 h,10000 r/min离心40 min(重复2次),取上清液加2倍体积Tris-HCl,加一定量木瓜蛋白酶,酶解12 h(pH6.8,60 ℃水浴振荡),煮沸10 min,灭酶,10000 r/min离心20 min除去蛋白,取上清加1/4体积氯仿、正丁醇(体积比4∶1),搅拌器剧烈搅拌30 min,重复操作,直至除去杂质蛋白,离心,取上清,旋转蒸发浓缩至50 mL加4倍无水乙醇醇沉过夜。10000 r/min离心10 min,取沉淀抽滤,无水乙醇、丙酮洗沉淀,得粗多糖。

1.2.2单因素实验根据研究者发现,在多糖提取工艺中,料液比、浸提液pH和加酶量三因素是影响多糖得率的三个重要因素,因此本实验选取料液比、浸提液pH和加酶量为三因素进行单因素实验[15]。

1.2.2.1料液比对鸢乌贼墨多糖提取的影响调节浸提液pH为5.5、加酶量1%的条件下,选取料液比分别为:1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5,提取鸢乌贼墨多糖,并测定料液比对粗多糖中多糖含量、蛋白含量及粗多糖得率的影响。

1.2.2.2浸提液pH对鸢乌贼墨多糖提取的影响选取料液比1∶2、加酶量1%,调节浸提液pH为3.5、4.5、5.5、6.5、7.5五个水平,测定浸提液pH对粗多糖中多糖含量、蛋白含量及粗多糖得率的影响。

1.2.2.3加酶量对鸢乌贼墨多糖提取的影响选取料液比为1∶2、浸提液pH5.5,调节加酶量分别为:0.5%、0.8%、1%、1.2%、1.5%五个水平,进行单因素实验,提取鸢乌贼墨汁粗多糖,并测定粗多糖中多糖含量、蛋白含量及粗多糖得率随加酶量的变化。

1.2.3响应面实验设计在上述单因素实验的基础上,以Y(多糖含量(%)×粗多糖得率(%)×104)为响应值[16],进行三因素三水平的响应面实验,选出鸢乌贼墨多糖最佳提取工艺。因素与水平取值见表1。

表1　响应面实验设计因素水平表

1.2.4多糖含量测定苯酚硫酸法[17-18];分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL 0.04 mg·mL-1的标准葡萄糖溶液于具塞比色管中,各以蒸馏水补至2.0 mL,同时以2.0 mL蒸馏水作为空白,然后加6%苯酚1 mL及浓硫酸5 mL,摇匀,冷却,室温放置20 min后,于490 nm处测吸光值,横坐标为多糖含量,纵坐标为吸光值,绘制标准曲线。取鸢乌贼墨多糖适量溶于水制成0.05 mg/mL,测吸光值,代入标准曲线方程计算多糖含量。

1.2.5蛋白含量的测定考马斯亮蓝法[19]。

1.2.6鸢乌贼墨汁多糖得率鸢乌贼墨汁多糖得率的计算式为[20]:

鸢乌贼墨汁粗多糖得率(%)=粗多糖质量(g)/南海鸢乌贼墨汁质量(g)×100。

1.2.7数据分析每组实验做三个平行,采用Design-Expert V8.0.6 软件对响应面实验进行回归分析[21-22]。

2　结果与分析

2.1多糖含量测定

根据苯酚硫酸法,于490 nm处测吸光值,横坐标为多糖含量,纵坐标为吸光值,绘制标准曲线,见图1。

图1　葡萄糖的标准曲线Fig.1　The standard curve of glucose

2.2单因素实验

2.2.1料液比对鸢乌贼墨多糖提取的影响结果如图2所示。

图2　多糖含量、蛋白含量及粗多糖得率随料液比的变化Fig.2　The change of the polysaccharide,protein content and crude polysaccharide extraction yield alongwith the change of material liquid ratio

由图2可知,多糖含量及得率随料液比的增加而增加,但是当料液比达到1∶2时,随着料液比的增加,多糖含量及得率变化不明显,而蛋白含量随料液比的变化无明显变化,实验过程中,随着料液比的增加,会增加操作困难,为方便实验操作,节约资源,因此,料液比选择1∶2。

2.2.2浸提液pH对鸢乌贼墨多糖提取的影响结果如图3所示。

图3　多糖含量、蛋白含量及粗多糖得率随浸提液pH的变化Fig.3　The change of the polysaccharide,protein content and crude polysaccharide extractionyield along with the change of pH value

由图3可知,粗多糖中多糖含量及蛋白含量均随着浸提液pH的增加而增大,而多糖得率则随着pH的增大而呈现先升后降的趋势,当pH为5.5时,粗多糖得率达到最大,这可能是由于pH在3.5～5.5之间,随着pH的增大,酸性条件下沉淀的黑色素逐渐溶解,多糖也随之被浸提出,多糖含量、蛋白含量和得率均随之升高,在pH5.5时粗多糖得率达到最大,但当pH继续增加,大量黑色素溶解,蛋白含量随着升高,增加了去除蛋白及黑色素的难度,而在去除蛋白及色素时会损失部分多糖,导致得率降低且粗多糖色素较深,影响后续实验,因此,浸提液pH选择pH5.5为最佳值,进行响应面实验。

2.2.3加酶量对鸢乌贼墨多糖提取的影响结果如图4所示。

图4　多糖含量、蛋白含量及粗多糖得率随加酶量的变化Fig.4　The change of the polysaccharide,protein content and crude polysaccharide extraction yield alongwith the change of enzyme concentration

由图4可得,加酶量为0.5%～1.0%之间时,多糖含量随着加酶量的增加而增大,而蛋白含量随着加酶量的增加直线下降,但当加酶量达到1%后,多糖及蛋白含量随着加酶量的增加呈稳定状态,几乎无变化,粗多糖得率随着加酶量的增加而略呈下降趋势,这可能是由于随着加酶量的增加,蛋白去除效果越好,但是随着加酶量的继续增加,需反复用氯仿、正丁醇除蛋白,会损失部分多糖,导致得率降低,因此,选取加酶量1%最宜实验。

2.3响应面分析

2.3.1响应面实验方案设计及结果分析根据Box-Behnken中心组合实验设计原理,对料液比、浸提液pH和加酶量三因素以Y为响应值进行三因素三水平响应面分析实验,共17个实验点,其中5个中心实验点,中心组合实验设计方案及实验结果分别见表2、表3。

表2　Box-Behnken实验设计及响应值

利用Design Expert 8.0.5b对实验结果进行回归分析,得到响应值Y与料液比、浸提液pH、加酶量三个因素的三元二次模拟方程为:

Y=8.87+0.018A-0.033B-4.500E-003C-0.064AB+0.035BC-0.13A2-1.15B2-0.07C2

由表3回归分析结果可知,回归模型p<0.01,失拟项p>0.01，相关系数R2=0.9999,说明这种方法具有统计学意义,纯误差小,与实际拟合较好,使用该方法优化鸢乌贼墨多糖的提取条件是可行的。由p值可知,A、B、AB、BC、A2、B2、C2对Y值的影响极显著。

表3　回归模型方差分析结果

图5　各因素之间的响应面图及等高线图Fig.5　The response surface figure and contour map between the various factors

注:**表示极显著(p<0.01)。

2.3.2响应面曲面分析利用Design Expert 8.0.6对表3数据进行分析,所得响应面及等高图见图5,各因素间的交互作用对响应值的影响可通过响应面图直观的反映出来,其中等高线的形状及疏密程度可反应两因素交互作用的强弱,圆形表示两因素的交互作用较弱,而椭圆形表示交互作用较强[18,23]。图5反映各因素对响应值Y的影响,图中最小椭圆中心点为响应值最高点。

图5(a)为加酶量为中心点时,浸提液pH与料液比对响应值Y的影响,由图可看出,浸提液pH与料液比的交互作用较强,随着料液比的增大和浸提液pH的增加,Y值随之而变化,但Y值沿料液比方向变化缓慢,而沿浸提液pH方向变化幅度较大,因此,浸提液pH对响应值Y的影响较显著,表现为曲线相对较陡,而料液比曲线较为平缓。

从图5(b)看出,随着料液比和加酶量的变化,Y值都有所变化,但相对于加酶量对Y值变化,Y值沿料液比方向变化幅度较大,等高线接近圆形,加酶量与料液比交互作用较弱,料液比等高线曲线较密集,而加酶量等高线曲线较稀疏,表现为相对于加酶量对Y值的影响,料液比对Y的影响较显著。

从图5(c)可看出,随着浸提液pH的变化,Y值先增大后减小,变化幅度较大,曲线较为陡峭,而随着加酶量的变化Y值也有所变化,但是变化幅度相比于浸提液pH较小,曲线较平缓,浸提液pH与加酶量的交互作用较强,表现为浸提液pH对响应值Y的影响较显著,而加酶量对Y值影响相对较小。

2.3.3最优工艺条件的预测及验证Design-Expert V8.0.6对数据进行分析预测得:因素影响大小顺序为:浸提液pH>料液比>加酶量;响应值Y的最佳工艺参数为:料液比1∶2.02、浸提液pH5.49、加酶量1.00%,此条件下预测Y值为8.8748,粗多糖得率为0.92%,多糖含量为9.75%。根据实际实验的可操作性,将工艺参数修正为:料液比1∶2、浸提液pH5.5、加酶量1.00%,在此条件下进行验证实验得到粗多糖得率为0.91%,多糖含量为9.8%,与理论值相比,相对误差为0.4%,与模型值接近,优化结果可靠。

3　结论

通过单因素实验和Box-Behnken实验设计以料液比、浸提液pH、加酶量为三因素,Y为响应值,对南海鸢乌贼墨汁多糖的提取进行优化,得出鸢乌贼墨多糖的最佳提取工艺参数为:料液比1∶2、浸提液pH5.5、加酶量1.00%,此条件下粗多糖得率为0.91%,多糖含量为9.8%,采用响应面法优化鸢乌贼墨多糖提取工艺,取得最佳提取工艺,且具有可行性。

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Optimization of extraction technology polysaccharide from the ink of theSthenoteuthisoualaniensisin South China Sea by response surface methodology

YANG Li-zhi1,2,YANG Xian-qing1,*,HUANG Hui1,LI Lai-hao1,DENG Jian-chao1,ZHAO Yong-qiang1,YANG Shao-ling1

(1.Key Laboratory of Aquatic Product Processing,Ministry of Agriculture,National R & D Center for Aquatic Product Processing,South China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Science,Guangzhou 510300,China;2.College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

Objective:To explore the optimum extraction process of polysaccharide from the ink of theSthenoteuthisoualaniensisin South China Sea,response surface methodology(RSM)was employed to optimize extraction process of polysaccharide from the ink of theSthenoteuthisoualaniensis. Methods:Experiment factors and levels were first selected on the ground of single factor experiment .Along with the center combination experiment design principle,three factors and three levels of response surface analysis were adopted to obtain a multiple quadratic linear regression equation and analyzed the interaction among factors chosen Y(polysaccharide content×total sugar quality,100 g ink extraction product of quality of crude polysaccharide and total sugar content%)as the response value. Results:The optimum extraction conditions of polysaccharide from the ink of theSthenoteuthisoualaniensisin South China Sea were concluded as follows:ratio of solid to liquid 1∶2,water extract pH5.5,enzyme concentration 1.00%. Under this condition,polysaccharide content and crude polysaccharide extraction yield value of polysaccharide from the ink of theSthenoteuthisoualaniensiswas 9.8% and 0.91% respectively. Conclusion:The RSM was employed to optimize extraction process of polysaccharide from the ink,which had feasibility and good effect.

Sthenoteuthisoualaniensis;ink polysaccharide;extraction;response surface methodology

2016-01-18

杨丽芝(1989-),女,硕士,研究方向:水产品加工与质量安全,E-mail:yanglizhi926@126.com。

杨贤庆(1963-),男,研究员,研究方向:水产品加工与质量安全,E-mail:yxqgd@163.com。

农业部财政重大专项(NFZX2013);南海渔业资源调查与评估。

TS254.1

B

1002-0306(2016)18-0292-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.047