甘肃武威薄皮核桃茎尖组织培养中防褐变措施的研究

张春梅，闫 芳，陈杰昌，白 鹏

（1.河西学院农业与生物技术学院，甘肃 张掖 734000；2.河西学院生态与绿洲农业研究院，甘肃张掖 734000；3.金昌市永昌县花草滩林场，甘肃永昌 737200）

甘肃武威薄皮核桃茎尖组织培养中防褐变措施的研究

张春梅1，闫 芳2，陈杰昌3，白 鹏1

（1.河西学院农业与生物技术学院，甘肃 张掖 734000；2.河西学院生态与绿洲农业研究院，甘肃张掖 734000；3.金昌市永昌县花草滩林场，甘肃永昌 737200）

以多年生武威薄皮核桃茎尖为试材，研究了培养基成分、不同种类和质量浓度的褐变抑制剂、生长调节剂以及转瓶周期对其褐变的影响。结果表明：培养基成分、褐变抑制剂、生长调节剂和转瓶周期对外植体褐变的影响均不同；为抑制褐变及保证茎尖正常分化生长，先将茎尖接种于1/2 MS+2 g/L活性炭的培养基中，置于5℃冰箱中暗培养7 d后取出，再转接于DKW+ 6-BA（1.0 mg/L）+IAA（0.01 mg/L）+5 mL 20％硫代硫酸钠的培养基中，置于25℃室内光照环境下培养，每隔3～5 d转换1次培养基，能有效抑制褐变。

核桃；组织培养；褐变；抗氧化剂

0 引言

核桃（Juglans regia）系胡桃科，属于多年生植物，是世界著名四大干果之一。目前，世界核桃年产量92万吨。我国作为核桃原产地之一，栽培历史悠久。核桃在我国分布广泛，年产30万吨，占世界1/3，种质资源极为丰富。云南年产6.1万吨，占全国产量1/5，产值达6亿元，已经成为我国核桃的主产大省。［1］

核桃以其很高的经济、生态和社会效益而被广泛种植，［2-5］其潜在的营养价值和医疗保健功能日益受到国内外专家学者的关注，深受消费者喜爱。

随着植物组织培养技术的兴起，为核桃的快速繁殖和组培、细胞水平的遗传改良提供了一条有效的途径。［6-7］褐化现象是果树组织培养中的普遍现象，桃［8］、杏［9］、樱桃［10］、李［11］等都有关于褐变的报道，核桃表现的更为明显。其外植体一般在接种后就出现褐变，最后导致外植体褐变死亡，因此，难以建立无性繁殖体系。［12］因而，在核桃离体培养中，防止外植体褐变死亡是其能否培养成功的关键。在培养基中添加抗氧化剂或酚类吸附剂是防止外植体褐变的常用的方法。［13］本实验以多年生武威薄皮核桃茎尖为试材，研究在培养基中加入不同褐变抑制剂对核桃茎尖褐变的影响，以期为核桃的快速繁殖和组培奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料的选择

本实验选取了多年生武威薄皮核桃的优质茎尖，1 cm长的切段。实验于2013年5月至2014年7月在河西学院生命科学实验楼植物组织培养室进行。

1.2 茎尖的灭菌

将除去叶片鳞片的茎尖用自来水冲洗0.5 h，然后用70％的酒精溶液浸泡0.5～1 min（幼树茎尖可以不用酒精浸泡），再用0.1％的升汞溶液［14］浸泡7～10 min（幼树茎尖灭菌时间相对短一些，为7～8 min，成年老树茎尖灭菌时间相对长一些，为9～10 min）。取出后用无菌水漂洗5次，接种到适当的培养基上诱导其生长。

1.3 培养基及应用方法

实验采用两种基本培养基（1/2 MS+2 g/L活性炭、DKW）与添加6-BA 1.0 mg/L和IAA 0.01 mg/L的组合培养基进行对比。采用两步法：第一步将茎尖接种于培养基上，在5℃冰箱中黑暗放置7 d；第二步放于25℃室内自然光照环境中培养。培养基的pH值为6.2，琼脂6.0 g/L，糖30 g/L。后期培养的基本培养基为DKW。在DKW+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.01 mg/L培养基中添加不同含量的褐变抑制剂（维生素C、20％Na2S2O3、活性炭）［15］，比较其对生长及褐变的影响。

在DKW培养基中添加不同质量浓度植物生长调节剂（6-BA、2，4-D、NAA、IAA）［16］比较其对生长及褐变的影响。

2 结果分析

2.1 不同培养基对核桃茎尖生长及褐变的影响

取生长健壮的茎尖做实验材料，在各种培养基上各接种10个外植体，重复2次，其他条件均一致，观察不同培养基上外植体的情况，结果见表1。

表1 不同培养基对核桃茎尖生长及褐变的影响Table 1 The effects of different medium on growth and browning of the walnut shoot tips

由表1可知，在1/2 MS+2 g/L活性炭培养基中，茎尖褐变率较低，但生长不明显或无生长；在DKW+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.01 mg/L组合培养基中，褐变率偏高，但外植体有生长；在1/2MS+2 g/L活性炭+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.01 mg/L组合培养基中，生长弱或无生长现象，褐变率可维持在一定范围内。

改变培养环境进行实验，将接种好的外植体置于5℃冰箱中7 d后取出，再置于25℃室内自然光照条件下培养，褐变率有所降低。实验表明，将外植体接种于1/2 MS+2 g/L活性炭的培养基中，置于5℃冰箱黑暗培养7d后取出转接于DKW+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.01 mg/L培养基中，置于25℃室内自然光照培养，降低褐变率效果较好，但随时间延长，褐变现象也随之出现并趋于严重，因此还需要采取措施进一步抑制褐变。

2.2 添加不同质量浓度的褐变抑制剂对核桃茎尖生长及褐变的影响

在DKW+6-BA 0.1 mg/L+IAA 0.01 mg/L组合培养基中添加不同褐变抑制剂进行实验，结果见表2。

由表2可知，不同种类和不同质量浓度的抗氧化剂、抑制剂、吸附剂对核桃茎尖的生长分化和褐变有不同影响。在各种配比的培养基中，以添加5 mL 20％Na2S2O3的培养基效果最好，褐变得到一定控制，茎尖生长与其他组织相比有明显改善。

表2 在培养基中添加不同添加剂浓度的褐变抑制剂对褐变的影响Table 2 The effects of the medium add the different additives browning inhibitors on browning

2.3 不同生长调节剂对核桃茎尖生长及褐变的影响

在DKW培养基中添加不同种类和不同质量浓度的生长调节剂，观察其对茎尖的生长分化和褐变的影响，结果见表3。

表3 在DKW培养基中添加不同的生长调节剂对褐变的影响Table 3 The effects of the DKW medium add the different growth regulator

由表3可知，采用DKW+6-BA 1.0 mg/L+ IAA 0.01 mg/L+5 mL 20％Na2S2O3的培养基，在25℃室内自然光照下培养，可有效控制褐变的产生。随着6-BA质量浓度的升高，褐变率也随之增高，褐变反应时间提早，先是出现絮状物，之后逐渐扩散，最终死亡。质量添加2，4-D、IAA的组合中，褐变反应时间稍推迟，培养基上有絮状物产生。

2.4 外植体转瓶周期对核桃茎尖生长及褐变的影响

在实验中，进行3个周期（5 d、10 d、20 d）的转瓶，观察现象，结果见表4。

由表4可知，5 d转瓶1次，既不影响茎尖生长，又可有效抑制褐变。对于易褐变的材料，若接种后转瓶周期时间长，伤口周围积累的酚类物质增多，会加重褐变。

表4 不同转瓶周期对核桃茎尖生长及褐变的影响Table 4 The effects of different rotating period on growth and browning of the walnut shoot tips

3 结果与讨论

目前认为植物组织培养中的褐变多数是由酶促褐变引起的，［17］培养材料褐变是由伤口分泌的酚类化合物被氧化的结果。［18］酚类的糖苷化合物是木质素、单宁和色素的合成前体。因此，当酚类化合物含量高时，木质素、单宁或色素的形成就多，易导致褐变的发生。［19］培养材料的种类与品种、外植体的生理状态、营养状况、生长部位等内因，以及培养基成分、添加激素的种类和浓度、培养条件等外因，都会影响褐变的发生。前人已经对影响蝴蝶兰［20］、中华红叶杨［21］、银杏愈伤组织［22］等外植体褐变的因素进行了研究。本实验是针对核桃组培中产生褐变的外因进行研究，通过改变培养基的种类及其成分，控制初代培养中的褐变。

3.1 不同培养基对核桃茎尖生长及褐变的影响

本实验采用1/2 MS+2 g/L活性炭。先将其置于5℃冰箱内暗培养1周后取出，再转接于DKW +6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.01 mg/L培养基中，置于25℃室内自然光照下培养，减少酚类物质外溢，减轻褐变，并可在一定时间内维持外植体生长不受褐变影响，这与前人的研究结果一致。［20-21］但随着时间延长，又出现褐变现象并趋于严重，需添加其他抑制剂来抑制褐变的发生。

3.2 添加不同质量浓度的褐变抑制剂对核桃茎尖生长及褐变的影响

张智等人在抗氧化剂对银杏愈伤组织褐变影响的实验中表明，不同质量浓度的维生素C（Vc）、柠檬酸、镤（PA）3种抗氧化剂对抑制褐变的效果为：Vc＞柠檬酸＞PA；［22］张红在库拉索芦荟组培中的褐变现象及防止实验中表明：用库拉索芦荟茎尖做外植体，MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L做培养基，并加入活性炭500.0 mg/L，环境温度控制在25℃有利于减轻褐变。［23］本实验中，通过添加不同褐变抑制剂表明：培养基中添加5 mL 20％ Na2S2O3能有效抑制褐变且不影响植株生长，这与前人的研究结果一致。［24］

3.3 不同生长调节剂对核桃茎尖生长及褐变的影响

不同种类和质量浓度的植物生长调节剂对核桃茎尖生长及褐变有一定影响，高质量浓度6-BA刺激酚类污染，而生长素2，4-D及IAA能延缓多酚合成从而减轻褐变。实验证明：在DKW培养基中加入6-BA 1.0 mg/L和IAA 0.01 mg/L较适宜核桃茎尖生长并能够减轻褐变，这与前人的研究结果稍有不同，究其原因应该是所研究的品种不同。［25］

3.4 外植体转瓶周期对核桃茎尖生长及褐变的影响

接种后，外植体培养时间过长，未及时转移，伤口周围积累酚类物质增多，褐变加重，甚至导致外植体死亡，这种现象在组培中经常可见。适当缩短转瓶周期，可减少伤口周围酚类物质的积累，从而减轻褐变。

3.5 温度、光照对核桃茎尖生长及褐变均有影响

本实验前期采用低温（5℃）黑暗处理旨在利用低温抑制酚类化合物的合成，降低多酚氧化酶活性，减少酚类氧化，从而减轻褐变。但低温时间过长，植株存活率随之下降，这与前人的研究结果一致。［26-27］实验表明，低温宜控制在7 d左右，暗处理之所以能控制外植体褐变，是因为在酚类化合物的合成和氧化过程中，有许多酶系统参与，其中部分酶系统的活性是受光诱导的。因此，前期需无光培养，后期转至25℃室内自然光条件下培养。

［1］陆斌.核桃营养药用价值与加工技术研究进展［J］.中国果菜学报，2006（4）：41-43.

［2］肖文武.安徽山核挑生产现状与发展对策［J］.经济林研究，2003，21（2）：74-76.

［3］姬孝忠.甘肃核挑资源及开发利用［J］.经济林研究，2003，21（3）：78-79.

［4］张日清，李江，吕芳德，等.我国引种美国山核挑历程及资源现状研究［J］.经济林研究，2003，21（4）：107-109.

［5］郭传友，黄坚铁，方炎明.山棱挑研究综述及展望［J］.经济林研究，2004，22（1）：61-63.

［6］张琴，刘蕾良.石芽生物学特性观察［J］.经济林研究，2001，19（1）：17-19.

［7］吕守芳，闫爱玲，吴燕民，等.核桃离体繁殖技术［J］.经济林研究，2004，22（1）：12-14.

［8］江虎军，潘季淑，孟新法.桃茎尖培养技术研究［J］.北京农业大学学报，1993，19（1）：49-52.

［9］马锋旺，张军科，李嘉瑞.杏离体繁殖的研究［J］.西北农业大学学报，1999，27（4）：12-15.

［10］阎贤伟.甜樱桃茎尖培养和快速繁研究［J］.园艺学报，1990，17（4）：275-279.

［11］邹英宁，李国怀，樊青峰，等.不同抗氧化剂对中国李茎段培养的影响［J］.华中农业大学学报，2006，25（1）：84-86.

［12］张俊林，刘庆忠，刘松，等.核桃茎尖培养中防止褐变的方法［J］.北京农学院学报，2007，22（2）：17-19.

［13］Jain N，Babbar S B.Regeneration of juvenile plant s of black plum，S yz y gium cuminii S keels，form nodal exp of matu retrees［J］.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2003（73）：257-263.

［14］张小红.核桃组织培养中外植体材料的初代培养研究［J］.陕西林业科技，2005（2）：6-8.

［15］孔祥生，张妙曩.甜柿离体繁殖技术的研究［J］.华中农业大学学报，1998（2）：178-186.

［16］刘兰英.薄壳香核桃组培中的褐化及防治措施口［J］.园艺学报，2002，29（2）：171-172.

［17］Asmus B，Hamme H.Enzymatic browning of vegetables cali-bration and analysis of variance by mutiway methods［J］. Chemometrics Intelligent Laboratory Systems，1996（34）：85.

［18］段志芳，李方满.酚类化合物的氧化反应研究进展［J］.肇庆学院学报，2003，24（5）：4-5.

［19］谢丽霞，杜建伟，李海杰，等.植物组织培养中的褐变现象及解决途径［J］.垦殖与稻作，2006（1）：61-63.

［20］许传俊，李玲.几种培养基及光照对蝴蝶兰叶片外植体褐变的影响［J］.亚热带植物科学，2006，35（1）：9-12.

［21］李树丽.培养基中不同因素对中华红叶杨外植体褐变的影响［J］.江苏农业科学，2014（1）：63-66.

［22］张智，邵菊芳，滕婷婷，等.抗氧化剂对银杏愈伤组织褐变的影响［J］.安徽农业科学，2008，36（30）：17-19.

［23］张红.库拉索芦荟组培中的褐变现象及防止［J］.安徽农业科学，2008，36（6）：57-58.

［24］阙生全，彭凌，朱必凤，等.油茶组织培养过程中防止褐变的研究［J］.韶关学院学报，2006（3）：8-10.

［25］吕校石.椴树组织培养研究［D］.石家庄：河北农业大学，2004：26-27.

［26］李树丽.温度及光照条件对中华红叶杨外植体褐变的影响［J］.北方园艺报，2014（4）：94-96.

［27］潘梅，王景飞，黄赛，等.淮山组织培养抑制褐变的研究［J］.江苏农业科学，2014（6）：26-28.

（责任编辑 柴 智）

The Study of the Anti-Browning in Tissue Culture of the Walnuts

ZHANG Chun-mei1，YAN Fang2，CHEN Jie-Chang3，BAI Peng1
（1.College of Agriculture and Biology Technology，Hexi University，Zhangye Gansu 734000，China；2.Ecological&Oasis Agricultural Research Institute of Hexi University，Zhangye Gansu 734000，China；3.Flower-grass Beach Forest Farm，Yongchang，Jinchang City，Gansu 737200，China）

Taking the perennial walnut shoot tips as materials，we have studied the effects of medium ingredients，browning inhibitors of different kinds and concentrations，growth regulators and the rotating period on the browning of explants.The results showed that the effects of ingredients，browning inhibitors and rotating period on the browning of walnuts explants are different.Moreover，we first stem tip into 1/2 MS+2 g/L of active carbon medium，which can be placed on the refrigerator during 7 days under 5℃darkness in order to browning inhibition system and guarantee the growth and normal differentiation of stem tip.Thus，it was inoculated into DKW+6-BA（1.0 mg/L）+IAA（0.01 mg/L）+5 mL 20％Na2S2O3medium，converted one medium per every 3-5 days，which can effectively inhibit browning of walnut.

Walnut；Tissue culture；Browning；Antioxidants

S 664.1

A

1005-0310（2016）03-0043-05

10.16255/j.cnki.ldxbz.2016.03.008

2013-05-11

甘肃省高校河西走廊特色资源利用省级重点实验室项目（项目号XZ1003）。

张春梅（1978-），女，甘肃酒泉人，河西学院农业与生物技术学院副教授，博士，主要从事植物生理、植物组织培养研究。E-mail：zazcm197828@163.com