双向电泳结合免疫印迹技术分析蜉蝣变应原

刘　硕，蔡笃程，李春林，孟　光，龙　绮，谢伟伟

(海口市人民医院耳鼻咽喉头颈外科， 海口 570208)

蜉蝣为一种有翅昆虫，常见的有蜉蝣科(Ephemeridae)和四节蜉蝣科(Baetidae)。蜉蝣稚虫水生，成虫不取食，寿命很短，其尸体风干后碎屑随风漂浮，可引起呼吸道过敏[1]。海口市人民医院耳鼻咽喉科门诊在之前的工作中发现，海南省对蜉蝣过敏的变应性鼻炎患者人数众多，而目前尚未见针对蜉蝣致敏蛋白质的研究报道，本实验对海南四节蜉蝣变应原蛋白质组分进行了分析，获得了完整的、高清晰度的蜉蝣蛋白质双向电泳图谱，结合免疫印迹技术，更加直接地反映了蜉蝣的主要致敏蛋白，为获得单一的变应原并为其以后的标准化工作打下基础。

材料与方法

标本来源

于海南大学校内水流边用黑光灯诱捕蜉蝣，经海南大学环境与植物保护学院教授参照文献[2]鉴定后，选择最常见的海南四节蜉蝣，-80 ℃冰箱保存。

主要试剂及仪器

固相pH梯度(immobilized pH gradient，IPG)干胶条(24 cm，pH 4～10)、丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfonate，SDS)及相应平衡溶液购自GE公司；二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)购自Amresco公司；尿素、硫脲购自AmershamPharmcia Biotech公司；碘乙酰胺(iodoacetamide，IAA)、矿物油购自BIO-RAD公司；苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸等购自 Sigma公司；硝酸纤维素(nitrocellulose，NC)膜购自美国Life Science公司；ECL 化学发光试剂盒购自北京康为世纪公司；鼠抗人IgE抗体购自Southern公司；蜉蝣变应原点刺液购自北京新华联协和药业有限公司。其他试剂均为国产分析纯试剂。主要的实验仪器及图像分析软件：等电聚焦系统(GE ETTAN IPGPHOR3)，垂直电泳系统(GE ETTAN DALTsix)，双向电泳凝胶图像分析系统ImageMaster2Dplatinum5.0(GE)。

蜉蝣过敏患者血清的选择

选择在海口市人民医院耳鼻咽喉科门诊就诊的过敏性鼻炎患者，多表现为反复鼻痒、喷嚏、鼻塞、清水样鼻涕，常有流泪，耳、眼、咽痒，前鼻镜检查见鼻黏膜苍白水肿，过敏性鼻炎的诊断符合“变应性鼻炎诊疗纲要2008”及我国过敏性鼻炎指南的诊断标准[3- 4]。蜉蝣过敏原皮肤点刺试验阳性(++～++++)，从中随机选择20例，取血清存于-80 ℃冰箱待用。

蜉蝣变应原蛋白质的提取

取蜉蝣约0.1～0.5 g，液氮研磨后加入裂解液{2 mol/L硫脲，7 mol/L尿素，4% 3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐}置入1.5 ml离心管，4 ℃，12 000 r/min离心20 min，离心半径为6 cm，收集上清液。对离心后的上清液进行超声处理，以破碎核酸，然后离心，4 ℃，12 000 r/min离心20 min，离心半径为6 cm，取上清液。将上清液分装成约为250 μl的3管，每管再加入1 ml预冷的丙酮，-20 ℃沉淀过夜。沉淀完成后，于4 ℃，12 000 r/min离心20 min，离心半径为6 cm，弃上清液，将得到的固体自然干燥，-80 ℃保存备用。

双向电泳

IPG 胶条的水化：取1 200 μg蜉蝣总蛋白与水化液{7 mol/L 尿素，2 mol/L硫尿，4% 3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐，1% DTT，1% IPG缓冲液，0.001%溴酚蓝}混匀，上样总体积为460 μl。从冰箱取出IPG胶条在室温下复温10 min。将样品溶液加到已经调节好水平的水化盘的样品槽中，轻轻撕下IPG胶条的覆盖膜，胶面朝下，酸性端朝顶端将胶条放入样品溶液中，操作过程要避免产生气泡。放好胶条后再加入1.2 ml矿物油于支持膜上保湿，室温20 ℃，胶条水化过夜(10～12 h)。

第一向等电聚焦：开机预冷，在等电聚焦盘中加入矿物油(每条泳道加入6 ml)。取出水化好的IPG胶条，吸干胶条上残留的矿物油，胶面朝上将胶条放入等电聚焦盘中。准备滤纸垫片，每个垫片加75 μl Milli Q水润湿，将垫片放胶面的两端，边缘与胶面边缘对齐，装上电极板，选择胶条数量后开始运行程序。等电聚焦仪(GE ETTAN IPGPHOR3)聚焦的条件为 500 V 1.0 h；1 000 V，1.0 h；8 000 V，3.0 h；8 000 V，2.4 h。聚焦完毕后将胶条保存于-70 ℃待用。

IPG胶条平衡：将等电聚焦后的胶条置于平衡溶液Ⅰ(6 mol/L尿素，2% SDS，0.375 mol/L Tris-HCl，20%甘油，2% DTT)中平衡10 min后立即转入平衡溶液Ⅱ(6 mol/L尿素，2% SDS，0.375 mol/L Tris-HCl，20%甘油，135 mmol/L碘乙酰胺)中平衡10 min。将平衡后的IPG胶条在10×SDS-PAGE电泳即用缓冲液(Tris-Glycine-SDS, pH 8.8)中漂洗30 s后用于第二向电泳。

第二向垂直SDS-PAGE电泳：平衡后的胶条转移至垂直电泳板上方，用含痕量溴酚蓝0.1%的琼脂糖封闭。凝胶采用4%的浓缩胶和12%的分离胶。电泳缓冲液为10×SDS-PAGE电泳即用缓冲液，电泳条件为16 mA 30 min，24 mA 5～6 h。

凝胶染色

电泳完毕后，凝胶置于约300 ml染色液中(0.25%考马斯亮蓝 R250，45.4%甲醇，9.2%冰醋酸)，室温，在摇床上染色至少30 min。染色完成后转入500 ml甲醇脱色液(5%甲醇，7.5%冰醋酸)脱色4～6 h或过夜。

免疫印迹分析

参照 Western blot标准操作规程，将蛋白质点转移至NC膜，转移条件：每块胶200 mA，2 h；转移完成后将NC膜置于含5%脱脂奶粉的封闭液中，4 ℃封闭过夜。弃封闭液，PBST洗膜 3次，每次10 min。加入1∶10稀释的一抗(实验组用封闭液稀释蜉蝣过敏鼻炎患者混合血清，对照组用封闭液稀释健康者血清)，孵育2 h。PBST洗膜3次，每次10 min。再加入辣根过氧化物酶(horseradish-peroxidase,HRP)标记的1∶4 000稀释的羊抗人IgE二抗(用封闭液稀释)孵育1 h。PBST洗膜3次，每次10 min。加入配制好的增强化学发光底物液，X光片曝光，暗室显影，定影，洗片。

图像扫描和分析

完成考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶用Imagescaner扫描，采用图像分析软件Imagemasters 6.0对扫描图像进行强度校正、点检测、背景消减和点匹配等。

结　　果

双向电泳凝胶蛋白图谱分析

使用图像分析软件对蜉蝣总蛋白双向电泳图谱进行分析，在相对分子质量为10 000～170 000和等电点3.0～10.0的范围内，发现约805个蛋白质点(图1)。

蜉蝣变应原免疫印迹图

免疫印迹检测结果显示，阳性组与对照组的比对图如下(图2)，阳性组一抗为对蜉蝣过敏的患者血清，对照组一抗为健康者血清；经过对比发现，蜉蝣特异性致敏蛋白组分约有27个点(图3，红色圆圈标注点)，这些点主要集中在等电点约4.5～7.5，相对分子质量约25 000～55 000。

图1　蜉蝣蛋白的双向电泳图谱(考马斯亮蓝R250染色)Fig 1　Total proteins of ephemeropterain 2-DE(coomassie-stained gel)Mr:相对分子质量

图2　蜉蝣变应原免疫印迹图谱Fig 2　Allergens of ephemeroptera in immunoblottingA:蜉蝣过敏患者血清; B:健康者血清Mr:相对分子质量

图3　蜉蝣特异性致敏蛋白组分Fig 3　Specific allergens of ephemeroptera图中红色方框表示阴性和阳性血清结果共有的斑点，红色圆圈表示阳性结果中独有的斑点，为蜉蝣特异性致敏蛋白组分Mr:相对分子质量

讨　　论

变应性鼻炎是鼻腔黏膜的变应性疾病，并可引起多种并发症，它主要由变应原进入鼻腔黏膜与相应的IgE结合而引起的一种变态反应性疾病。随着现代工业化进展、现代生活方式和人类生态环境的变化，变应性鼻炎的发病率呈逐年上升趋势。根据流行病学调查，欧洲变应性鼻炎平均患病率约为25%[5]，中国成人变应性鼻炎自报平均患病率则为11.4%[6]。海南省处于亚热带，全年气候炎热湿润，花木常开，变应性鼻炎患病率也是居高不下。在前期工作中，本研究组对蜉蝣临床致敏情况进行了研究[7]，在海口市人民医院耳鼻喉就诊的500例变应性鼻炎患者中，蜉蝣变应原点刺阳性所占比例达58.6%，可见蜉蝣为海南省重要变应原[8]。

本研究用双向电泳技术对蜉蝣变应原进行分析，以探明其致敏成分。双向电泳技术通过蛋白质本身等电点和分子量之间的差异可以达到对多种蛋白质进行高分辨、多信息分析[9]，是蛋白质研究当中分辨率最高的研究方法[10]。本课题组先后采用双向电泳技术对几种常见变应原进行了分析，均取得较好的效果[11]。本实验首先通过双向电泳分离了蜉蝣的总蛋白，共分离得到了805个蛋白点，相对分子质量约为20 000～130 000；等电点主要集中在4.0～9.5，通过双向电泳图谱可以对蜉蝣的蛋白质总体分布有明确的认识。本研究中的蜉蝣变应原蛋白质双向电泳图谱为国内外首次报道。随后应用免疫印迹技术，分别用蜉蝣过敏患者的血清和健康者血清进行实验，经过比对得到27个特异性蛋白点，在图中可以看出这些蛋白质点的等电点主要集中在 4.5～7.5，相对分子质量在25 000～55 000之间，与双向电泳图谱中高丰度蛋白质点分布相一致，一定程度上说明蜉蝣致敏性与蛋白质含量相关。在后续的研究中可以对这些蛋白质进行测序分析，直接获得变应原蛋白质的氨基酸序列，然后进行克隆表达和纯化，从而为获得单一的变应原并为其以后的标准化工作打下基础。本课题组已经完成对27个蛋白质点的质谱测序分析，结果将另行撰文发表。

变应性疾病的特异性诊断依赖于标准化的变应原制剂，而变应原蛋白质组分的确定可以为进一步获得纯化过敏原打下坚实的基础。因此，基于双向电泳的蛋白质组学技术可以对变应原蛋白质进行分析，有助于对致敏蛋白质进行纯化以及标准化，并最终获得基因工程重组的变应原应用于临床实践中。

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