微小染色体维持蛋白7在鼻腔鼻窦鳞状细胞癌中的表达及临床意义的研究

胡月，姜菲菲，韩佳利，丁晓旭，阎艾慧

（中国医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科，沈阳110001）

微小染色体维持蛋白7在鼻腔鼻窦鳞状细胞癌中的表达及临床意义的研究

胡月，姜菲菲，韩佳利，丁晓旭，阎艾慧

（中国医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科，沈阳110001）

目的检测微小染色体维持蛋白7（MCM7）在鼻腔鼻窦鳞状细胞癌（SNSCC）中的表达水平，分析其与肿瘤组织分化程度及患者预后的关系。方法采用免疫组化法检测SNSCC和慢性鼻窦炎鼻息肉（NPCRS）中MCM7的表达情况，并分析其与临床病理特征的关系。结果NPCRS中，MCM7阳性细胞主要分布于上皮基底层，且表达率较低。SNSCC中，MCM7阳性细胞呈弥漫性分布，且表达率较高。MCM7在SNSCC中的表达水平高于NPCRS，差异有统计学意义（P<0.001）。MCM7的表达仅与肿瘤分化程度有关（P=0.001），且随着分化程度的下降而逐渐增高。SNSCC患者总体3年和5年生存率分别为61.3%和46.0%。Ⅰ～Ⅲ期和Ⅳ期患者的3年生存率分别为90.0%和25.6%，5年生存率分别为70.0%和17.1%，差异有统计学意义（P<0.001）。MCM7阴性患者3年、5年生存率为36.0%和18.0%，而阳性患者3年、5年生存率为59.9%和34.2%，差异无统计学意义（P=0.297）。结论MCM7在SNSCC中表达水平显著升高，而且与肿瘤分化程度有关，随着肿瘤分化程度下降，MCM7表达水平逐渐增高，但与SNSCC患者的生存率无关。

微小染色体维持蛋白7；鼻腔鼻窦；鳞状细胞癌；免疫组织化学

鼻腔鼻窦癌是一类相对少见的恶性肿瘤，约占头颈部除肉瘤外的恶性肿瘤的3%［1］，其中以鼻腔鼻窦鳞状细胞癌（sinonasal squamous cell carcinoma，SNSCC）最常见。由于SNSCC发病的分子生物学机制尚不完全清楚，且起病隐匿、预后较差，一直受到临床医师的广泛关注。微小染色体维持蛋白7（minichromosome maintenance protein 7，MCM7）作为MCMs家族的主要成员之一，可与其他成员相互作用形成MCM4/MCM6/MCM7异三双聚体和MCM2/ MCM4/MCM6/MCM7异四聚体2种重要复合物。前者具有三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）酶和DNA解旋酶活性，参与DNA复制前复合物（pre⁃replication complex，pre⁃RC）的形成，调节细胞增殖活动；后者对前者的功能亦具有调节作用，且MCM7参与其重要结构——锌指模体的构成。YOU等［2］研究发现，MCM7参与构成的ATP酶模体对于这两种酶的激活具有决定作用。研究［3］发现，MCM7的表达水平可能与肿瘤患者预后相关，因此推测MCM7的差异性表达水平也可能与SNSCC的预后有关。本研究拟应用免疫组化技术检测MCM7在SNSCC等组织中的表达，旨在探讨其在SNSCC发病机制中的作用及临床意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集2010年12月至2016年5月于我科门诊活检及住院手术切除并经病理证实为SNSCC的存档蜡块54例，作为实验组。收集2016年4月于我科手术治疗的慢性鼻窦炎鼻息肉（nasal polyps with chronic sinusitis，NPCRS）标本10例，作为对照组。

1.2 主要试剂

兔抗人MCM7多克隆抗体（1∶200）购自武汉博士德生物工程有限公司，S⁃P试剂盒、DAB显色剂、苏木素染液和伊红染液均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 方法

每例石蜡标本常规4 μm连续切片3张，第1张采用苏木素—伊红染色，第2张采用免疫组化染色，第3张留存备用。

1.3.1 苏木素—伊红染色：第1张切片采用常规苏木素—伊红染色，染色结果由有经验的病理科医师阅片重新确诊，并对肿瘤组织的分化程度进行重新划分。其中，高分化7例，中分化26例，低分化21例。

1.3.2 免疫组化：第2张切片采用常规S⁃P三步法进行MCM7免疫组化染色，应用0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）高温高压热修复，DAB显色。以细胞核着棕黄色为阳性，根据文献［4］方法统计结果并适当调整。每张切片高倍镜（×400）下随机观察5个视野计数细胞数，每个视野细胞数不少于200个，计算每张切片的阳性细胞百分率，即阳性细胞指数（la⁃beling index，LI），结果取平均值。以LI≥0.76为阳性［3］。

1.3.3 临床资料收集：收集纳入研究的SNSCC住院患者病历，整理相关资料。疾病诊断方法根据国际抗癌联盟TNM分类标准第7版［5］进行重新诊断。共纳入SNSCC患者54例，男39例，女15例；年龄39～ 81岁，平均57.9岁；住院治疗患者41例，其中7例未接受手术治疗。临床分期为Ⅰ期2例，Ⅱ期2例，Ⅲ期16例，Ⅳ期21例。其中，4例伴有颈部淋巴结转移，且均为Ⅳ期患者。7例原发于鼻腔，5例原发于筛窦，1例原发于筛窦或额窦，21例原发于上颌窦。

1.4 SNSCC患者的治疗及随访

全部Ⅰ、Ⅱ期和部分Ⅲ期SNSCC患者采用鼻内镜鼻腔鼻窦肿瘤切除术，Ⅳ期患者均采用鼻侧切开或上颌骨切除术，并根据术中具体情况及术前协商选择性切除眶内容物或同期行颈部淋巴结清扫术，术后联合放疗。患者出院后定期随访至2016年11月1日。34例SNSCC患者参加随访，期间失访3例，失访率8.82%。全部患者生存时间4.13～70.60个月，中位生存时间为38.77个月。

1.5 统计学分析

采用SPSS 22.0统计软件分析处理数据。计量资料采用表示，2个独立样本的比较采用Mann⁃ WhitneyU检验（所有计量资料经检验为非正态分布资料）。生存分析采用Kaplan⁃Meier和log rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MCM7在NPCRS和SNSCC中的表达

如图1及表1所示，NPCRS中表达MCM7的细胞分布具有规律性，主要位于上皮基底层，而SN⁃SCC中表达MCM7的细胞则呈弥漫性分布，无明显规律。SNSCC中MCM7的表达率［（78.50±12.08）%］高于NPCRS［（57.29±4.03）%］，差异有统计学意义（P<0.001）。MCM7的表达仅与肿瘤分化程度有关（P=0.001），并且随着分化程度的下降，MCM7表达水平逐渐增高。

2.2 影响SNSCC患者预后的因素分析

如图2所示，34例SNSCC患者的3年、5年生存率分别为61.3%和46.0%。其中，Ⅰ～Ⅲ期和Ⅳ期患者的3年生存率分别为90.0%和25.6%，5年生存率分别为70.0%和17.1%，差异有统计学意义（P< 0.001）。MCM7阴性患者3年、5年生存率分别为36.0%和18.0%，而阳性患者3年、5年生存率分别为59.9%和34.2%，差异无统计学意义（P=0.297）。

图1 MCM7在各组织中的表达情况S⁃PFig.1 MCM7 expression in different tissuesS⁃P

表1 MCM7的表达与患者临床病理特征的关系Tab.1 Relationship between expression levels of MCM7 and clinical pathological indices

3 讨论

MCM7作为一种细胞因子，参与pre⁃RC的形成，启动DNA复制。主要受p16、人乳头状瘤病毒（hu⁃man papillomavirus，HPV）和细胞分裂周期蛋白6（cell division cycle protein，CDC6）等因子的影响，这些因子通过Rb/E2F途径与MCM7相互关联，调节细胞增殖活动。其中，p16蛋白可作用于细胞周期素/细胞周期依赖性激酶（cyclin/CDK）复合体，维持Rb蛋白的低磷酸化状态，促使Rb/E2F复合物紧密结合，从而削弱E2F对MCM7表达的促进作用，并且CDK可直接作用于MCM7使其磷酸化，导致MCM4/ MCM6/MCM7异三双聚体复合物的DNA解旋酶活性丧失，从而调控DNA复制［6］。HPV则主要由于其E7蛋白具有多个Rb蛋白结合位点，并易与低磷酸化的Rb蛋白结合，使依赖性酶蛋白体破坏，Rb蛋白活性降低，导致Rb/E2F复合物中的转录因子E2F游离，促使细胞由G1期进入S期，进而导致细胞周期调节失控［7⁃8］。人类CDC6因子同样受Rb/E2F复合物调控［9］，对细胞周期具有重要的调节作用。有研究［10⁃12］认为CDC6对MCMs具有招募作用，是其整合到pre⁃RC中的必备前提。

目前，在头颈部肿瘤研究领域中，针对MCM7的研究主要集中在喉癌等方面，研究［13］发现其表达水平可能对患者的预后具有预示作用。然而，关于在SNSCC中MCM7的表达情况，国内外尚未发现相关报道。

图2 影响SNSCC患者预后因素的生存曲线Fig.2 Survival curves of prognostic factors in patients with SNSCC

本研究发现，在SNSCC中，MCM7可以作为一种有效区分肿瘤与非瘤组织的新型细胞因子（P< 0.001）。研究［14⁃15］发现，MCM7的敏感性优于Ki⁃67，而且还有相关研究［3，13，16⁃17］证明MCM7的表达对患者预后具有一定影响。甚至，COLI等［16］通过对垂体腺瘤的研究发现，MCM7的异常表达可作为判断肿瘤复发的良好指标。本研究结果发现，随着肿瘤组织分化程度的下降，MCM7表达率逐渐提高，与国内外其他研究［15，18⁃19］基本一致。但是，本研究并未得出MCM7与肿瘤的临床特征及预后具有明确相关性的结论，这与李瑶等［20］对子宫颈癌及其癌前病变的研究结果基本吻合。这说明MCM7表达水平与患者各项临床指标确实无关。另外，本研究通过统计分析发现，SNSCC患者发病年龄多在55岁以上，这与世界卫生组织肿瘤分类系列（2005年）头颈分册记载的流行病学发病年龄统计结果一致［1］。

在病理组织学方面，由于SNSCC高分化病例本身较少见，而且本研究仅包括7例高分化组织标本，所以在组间比较时未将其单列1项，以减小误差。结果发现，不同的SNSCC组织细胞分化程度间MCM7表达水平不同（P=0.001），低分化肿瘤的表达率明显高于中、高分化者。以上结果表明，MCM7表达水平可以用于区分SNSCC细胞异型性大小，进而协助判断肿瘤恶性程度高低。这与部分国内外学者的研究［15，18⁃19，21］结果相同，即随着肿瘤组织分化程度的下降，MCM7表达率逐渐提高。除此之外，非肿瘤组织中MCM7阳性表达细胞分布具有规律性，主要分布在基底细胞层，然而在SNSCC中则呈弥漫分布，未见明显规律，这对于区分肿瘤组织与正常组织也具有重要参考意义。

本研究通过生存分析发现，Ⅰ～Ⅲ期患者的3年和5年生存率明显高于Ⅳ期患者（P<0.001），可见早期诊断及治疗对于SNSCC患者的预后至关重要。然而，由于鼻腔鼻窦恶性肿瘤首发症状多为进行性鼻塞和（或）涕中带血等常见症状，多不会引起患者本人注意，导致多数患者就诊时已为晚期，严重影响预后生存率和生活质量。此外，本研究中SNSCC患者的5年生存率为46.0%，此结果略高于梁青壮等［22］的39.6%，这可能与后者纳入研究的病例包括颅底患者有关，而Ⅳ期患者的5年生存率大致相同。本研究结果提示SNSCC患者的生存率仅与临床分期有关，而与MCM7阳性表达等因素无关。MCM7作为对肿瘤细胞异型性大小具有明确提示作用的细胞因子，虽然对患者生存率无影响，但仍可以猜测MCM7的高表达可能暗示肿瘤的侵袭性高于低表达者。由此可见，MCM7不仅可以作为区分肿瘤组织与正常组织的新型细胞因子，在辅助辨别鳞状细胞癌分化程度和预示肿瘤侵袭性方面也有一定作用。

［1］BARNES L，EVESON JW，REICHART P，et al.World Health Orga⁃nization classification of tumours.Pathology and genetics of head and neck tumours［M］.Lyon：IARC，2005：13-17.

［2］YOU Z，ISHIMI Y，MASAI H，et al.Roles of MCM7 and MCM4 sub⁃units in the DNA helicase activity of the mouse MCM4/6/7 complex［J］.J Biol Chem，2002，277（45）：42471-42479.DOI：10.1074/jbc. M205769200.

［3］ISHIBASHI Y，KINUGASA T，AKAGI Y，et al.Minichromosome maintenance protein 7 is a risk factor for recurrence in patients with Dukes C colorectal cancer［J］.Anticancer Res，2014，34（8）：4569-4575.DOI：10.3892/ijo_00000003.

［4］NISHIHARA K，SHOMORI K，FUJIOKA S，et al.Minichromosome maintenance protein 7 in colorectal cancer：implication of prognos⁃tic significance［J］.Int J Oncol，2008，33（2）：245-251.DOI：10.3892/ijo_00000003.

［5］EDGE S，BYRD DR，COMPTON CC，et al.Cancer staging manual［M］.7th ed.New York：Springer，2010：57-67.

［6］ISHIMI Y，KOMAMURA⁃KOHNO Y，YOU Z，et al.Inhibition of MCM4，6，7 helicase activity by phosphorylation with cyclin A/Cdk2［J］.J Biol Chem，2000，275（21）：16235-16241.DOI：10.1074/jbc. M909040199.

［7］XU W，LIU Z，BAO Q，et al.Viruses，other pathogenic microorgan⁃isms and esophageal cancer［J］.Gastrointest Tumors，2015，2（1）：2-13.DOI：10.1159/000380897.

［8］GALLOWAY DA，LAIMINS LA.Human papillomaviruses：shared and distinct pathways for pathogenesis［J］.Curr Opin Virol，2015，14：87-92.DOI：10.1016/j.coviro.2015.09.001.

［9］BORLADO LR，MÉNDEZ J.CDC6：from DNA replication to cell cy⁃cle checkpoints and oncogenesis［J］.Carcinogenesis，2008，29（2）：237-243.DOI：10.1093/carcin/bgm268.

［10］LIANG C，STILLMAN B.Persistent initiation of DNA replication and chromatin⁃bound MCM proteins during the cell cycle in cdc6 mutants［J］.Genes Dev，1997，11（24）：3375-3386.DOI：10.1101/ gad.11.24.3375.

［11］TANAKA T，KNAPP D，NASMYTH K.Loading of an Mcm protein onto DNA replication origins is regulated by Cdc6p and CDKs［J］. Cell，1997，90（4）：649-660.DOI：10.1016/S0092⁃8674（00）80526⁃7.

［12］DONOVAN S，HARWOOD J，DRURY LS，et al.Cdc6p⁃dependent loading of MCM proteins onto pre⁃replicative chromatin in budding yeast［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94（11）：5611-5616. DOI：10.1073/pnas.94.11.5611.

［13］NOWINSKA K，CHMIELEWSKA M，PIOTROWSKA A，et al.Cor⁃relation between levels of expression of minichromosome mainte⁃nance proteins，Ki⁃67 proliferation antigen and metallothionein I/II in laryngeal squamous cell cancer［J］.Int J Oncol，2016，48（2）：635-645.DOI：10.3892/ijo.2015.3273.

［14］史琳，张安文，罗宇，等.细胞周期正性调控因子的异常表达与甲状腺癌发生发展的关系［J］.南方医科大学学报，2013，33（7）：1031-1035.DOI：10.3969/j.issn.1673⁃4254.2013.07.19.

［15］CHOY B，LALONDE A，QUE J，et al.MCM4 and MCM7，potential novel proliferation markers，significantly correlated with ki67，bmi1，and cyclin e expression in esophageal adenocarcinoma，squa⁃mous cell carcinoma，and precancerous lesions［J］.Hum Pathol，2016，57：126-135.DOI：10.1016/j.humpath.2016.07.013.

［16］COLI A，ASA SL，FADDA G，et al.Minichromosome maintenance protein 7 as prognostic marker of tumor aggressiveness in pituitary adenoma patients［J］.Eur J Endocrinol，2016，174（3）：307-314. DOI：10.1530/EJE⁃15⁃0586.

［17］李蕙君，路晓薇，李春阳，等.口腔鳞癌和癌前病变中微小染色体维持蛋白7和细胞分裂周期蛋白6的表达研究［J］.中华口腔医学研究杂志（电子版），2010，4（3）：224-231.DOI：10.3877/ cma.j.issn.1674⁃1366.2010.03.003.

［18］林海瑞，童丹，宋文静.子宫颈上皮内瘤变及鳞状细胞癌中Rb、MCM7的表达及临床意义［J］.临床与实验病理学杂志，2014，30（6）：633-636.DOI：10.13315/j.cnki.cjcep.2014.06.011.

［19］闫洁，付敏，梁慧，庞永红，等.子宫颈鳞状细胞癌中Aurora⁃A、MCM7和HPV 16 E7的表达与临床病理特征的关系［J］.临床与实验病理学杂志，2015，31（5）：497-502.DOI：10.13315/j.cnki. cjcep.2015.05.004.

［20］李瑶，刘丽娜，杨永秀.MCM7、Ki67在宫颈鳞状细胞癌及其癌前病变中的表达及临床意义［J］.中国妇幼保健，2014，29（13）：2085-2088.DOI：10.7620/zgfybj.j.issn.1001⁃4411.2014.13.42.

［21］GUAN B，WANG X，YANG J，et al.Minichromosome maintenance complex component 7 has an important role in the invasion of pap⁃illary urothelial neoplasia［J］.Oncol Lett，2015，10（2）：946-950. DOI：10.3892/ol.2015.3333.

［22］梁青壮，吴跃煌，李德志，等.62例鼻腔鼻窦恶性内翻性乳头状瘤的治疗及预后［J］.中华肿瘤杂志，2015，37（2）：133-137. DOI：10.3760/cma.j.issn.0253⁃3766.2015.02.011.

（编辑 王又冬）

Expression and Clinical Significance of Minichromosome Maintenance Protein 7 in Sinonasal Squamous Cell Carcinoma

HU Yue，JIANG Feifei，HAN Jiali，DING Xiaoxu，YAN Aihui
（Department of Otorhinolaryngology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the expression of minichromosome maintenance protein 7（MCM7）in sinonasal squamous cell carcinoma（SNSCC），and evaluate its relationship with tumor differentiation and prognosis of patients.MethodsUsing immunohistochemistry，MCM7 ex⁃pression in SNSCC and nasal polyps with chronic sinusitis（NPCRS）were studied，and relationships between markers and clinicapathological fea⁃tures were analyzed.ResultsIn NPCRS，MCM7 positive cells were mainly distributed in the epithelial basal layer and the expression rate was low，whereas in SNSCC，MCM7 positive cells were diffuse and the expression rate was high.MCM7 expression was significantly higher in SNSCC than in NPCRS（P<0.001）and related to tumor differentiation（P=0.001），increasing gradually with decreasing degree of differentiation.The overall 3⁃and 5⁃year survival rates of patients with SNSCC were 61.3%and 46%，respectively.The 3⁃year survival rates for patients with stageⅠandⅣwere 90%and 25.6%，respectively，and the 5⁃year survival rates were 70%and 17.1%，respectively；the difference was statistically signifi⁃cant（P<0.001）.The 3⁃and 5⁃year survival rates of MCM7⁃negative patients were 36.0%and 18.0%，respectively，and those of MCM7⁃positive patients were 59.9%and 34.2%，respectively；the difference was not statistically significant（P=0.297）.ConclusionIn SNSCC，MCM7 expres⁃sion is significantly increased，inversely associated with the degree of tumor differentiation，and unrelated to the survival rates of patients.

minichromosome maintenance protein 7；sinonasal；squamous cell carcinoma；immunohistochemistry

R739.62

A

0258-4646（2017）04-0330-04

10.12007/j.issn.0258⁃4646.2017.04.011

辽宁省科学技术计划（2014225020）

胡月（1990-），男，硕士研究生.

阎艾慧，E-mail：yah567@sina.com

2016-11-22

网络出版时间：