牛病毒性腹泻病毒XC株的分离与鉴定

邓 宇 , 何学谦 ， 陈红军 ， 张 政

(西昌学院动物科学学院，四川 西昌 615013)

牛病毒性腹泻病毒XC株的分离与鉴定

邓 宇 , 何学谦 ， 陈红军 ， 张 政

(西昌学院动物科学学院，四川 西昌 615013)

将 BVDV阳性血清样品接种MDBK细胞，结果分离出1株BVDV 。采用MDBK细胞培养法、直接免疫荧光、RT-PCR与TCID50等方法对分离毒株进行鉴定分析。结果表明，分离株在MDBK细胞上盲传至10代均未出现细胞病变；在直接免疫荧光试验中呈阳性；RT-PCR扩增均获得5'-UTR、Npro预期大小DNA片段；分离株滴度为10-5.9TCID50/0.2 mL。进化分析显示，该分离株属于BVDV-1m。以上结果推断，成功分离鉴定1株BVDV，该分离株为非致细胞病变型BVDV-1m，命名为BVDV-1 XC株，为研究致病机理奠定基础。

牛病毒性腹泻病毒 ； 分离鉴定 ； 直接免疫荧光试验 ； 非致细胞病变型

牛病毒性腹泻病毒-1(Bovineviraldiarrheavirus-1，BVDV-1)、牛病毒性腹泻病毒-2(Bovineviraldiarrheavirus-2，BVDV-2)属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)成员[1]，与猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus， CSFV)、边界病毒(Borderdiseasevirus，BDV)同为一属，存在抗原交叉反应。这两种病毒(BVDVs)的基因组均为单股正链RNA，其大小约为12.3 kb，在基因分型方面，通常根据BVDVs的5'-UTR， BVDV-1可分为BVDV-1a～BVDV-1u[2-5]，BVDV-2可分为BVDV2a～ BVDV2d[6-7]。在生物型分类方面，基于病毒接种细胞是否产生病变将BVDVs分为致细胞病变型(Cytopathic effects，CPE)、非致细胞病变型(Noncytopathic，NCP)两种生物型。

本研究从西昌某牛场临床健康的奶牛血清样品中分离出一株BVDV毒株，将其命名为BVDV-1 XC株，生物型为NCP型。这为NCP型BVDV致病机制研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、标准毒株和主要试剂 MDBK细胞、BVDV 标准阳性对照毒株NADL，本实验室保存。病毒RNA提取试剂盒、2×PCRTaqMix等，购自天根生化科技(北京)有限公司；AMV反转录酶、克隆载体pMD19-T等，购自TaKaRa生物技术公司；牛血清、PBS、RPMI-1640培养基来自Hyclone产品；FITC标记BVDVs抗体来自美国VMRD公司产品。

1.2 样品来源与病毒分离 牛血清样品于2015年9月采自四川西昌某牛场临床健康的奶牛，将牛血清加入2倍PBS充分混匀，冻融3次，用0.22 μm滤器过滤，加入双抗(1 000 IU(μg)/mL)，接种至基本长满单层的MDBK，37 ℃，5%CO2吸附2 h，期间轻摇2～3次后弃上清，PBS洗涤2次，加入含10%牛血清的RPMI-1640在37 ℃，5%CO2条件下培养，72 h收集细胞培养物。盲传至10代，每代次细胞培养物置-75 ℃保存备用。

1.3 分离株的鉴定

1.3.1 RT-PCR鉴定 根据参考文献[5, 11-12]，设计合成引物，建立BVDV5'-UTR RT-PCR以及NproRT-PCR检测方法，对收集的细胞培养物进行检测，克隆测序。

1.3.2 抗原性鉴定(直接免疫荧光试验) 第4代分离毒株接种至基本长满单层的6孔板MDBK细胞，将BVDV NADL株、生理盐水分别设为阳性对照、阴性对照。置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养72 h后，根据FITC标记BVDV抗体试剂盒的操作说明书做直接免疫荧光试验(FA)，于倒置荧光显微镜下观察。

1.3.3 病毒TCID50测定 用含2%牛血清细胞培养基将分离毒株第5代病毒作10-1～10-8倍比稀释，分别接种于96孔细胞板，每一稀释度平行接4孔，200 μL/孔。同时设定4孔加入2%牛血清细胞培养基作为阴性对照， 37 ℃，5%CO2条件下培养72 h后，参照1.3.2方法进行染色、判定，记录荧光呈阳性的孔数及其稀释度，采用kärber公式计算TCID50。

1.3.4 遗传进化关系分析 采用Mega5.1软件对BVDV XC株 5′-UTR、Npro与GenBank中已公布的瘟病毒参考株相应的序列进行多序列比对，构建遗传进化树(用该软件参数：N-J法，Kimura 2-parameter，Transitions + Transversions，Bootstrap值1 000)分别构建5′-UTR(245 bp)、Npro(504 bp)，确定分离株与瘟病毒属其他毒株之间进化关系。

2 结果

2.1 分离毒株细胞传代培养及生物型鉴定 冻融3次的牛血清样品接种MDBK细胞，盲传至第8代，接种样品细胞(图1C)72 h后仍为NCP，与阴性对照组细胞(图1B)生长状态基本类似，无明显差异，结果表明，该分离株属于NCP生物型。标准阳性对照BVDV NADL株接种后72 h后出现明显CPE(图1A)，细胞出现明显空泡、圆缩、拉网等现象。

图1 细胞传代培养结果 (200×)

2.2 分离株 RT-PCR鉴定结果 采用RT-PCR对病毒盲传的第4代、第8代进行5'-UTR检测，结果均出现约309 bp大小的特异性片段(图2)，克隆、测序特异性片段，NCBI Blast结果显示，获得的序列为BVDV-1序列。

对分离株盲传第4代、第8代Npro基因进行RT-PCR检测，如图3所示，结果均扩增出约504 bp 大小的特异性片段，经克隆、测序，NCBI Blast显示，分离株为BVDV-1。

2.3 抗原性鉴定及毒力测定(TCID50) 分离株第4代感染MDBK细胞72 h后，用FA方法检测感染细胞，结果显示，被分离株感染的细胞、阳性对照，均出现特异性荧光反应。阴性对照无荧光反应(图4C)。

采用所建立的FA进行毒力测定，结果显示，0.2 mL分离株细胞培养上清中含105.9TCID50。

2.4 遗传进化分析

2.4.1 分离株 5'-UTR进化树构建 根据BVDV-1 5'-UTR序列所建立的进化树(图4)显示，分离株XC与BVDV-1m参考株ZM-95、LZ05在一个分支上。与其他BVDV-1参考株序列进行核苷酸同源性分析发现，该分离株与LZ05 、ZM-95核苷酸同源最高，分别为98.4%、95.5%，其可信度也达到73.0%、80.0%。

2.4.2 分离株Npro进化树构建 对BVDV-1 Npro的基因进行遗传进化分析，其结果表明，BVDV XC分离株与BVDV-1m参考株ZM-95、TJ0801同在一个分支，其可信度达到99.0%(图5)，核苷酸同源性分析表明，分离株与BVDV-1m参考株ZM-95、TJ0801同源性也是最大的，达到了94.4%、93.1%。

图2 分离株5′-UTR RT-PCR扩增结果

图3 分离株Npro RT-PCR扩增结果

图4 BVDV XC株5'-UTR进化分析

图5 BVDV XC株Npro进化分析

3 讨论

BVDVs自20世纪80年代首次在我国报道以来[11]，在我国广泛流行，部分牛场血清阳性率高达100%[12-13]。CP型与NCP型BVDVs均可引起牛只感染，但NCP 型是当前牛群中主要流行的生物型，唯有NCP能导致机体持续性感染[14]。由于本次试验获得的分离株BVDV-1 XC是临床健康牛的血清样品分离的NCP毒株，为研究BVDVs持续性感染致病机理奠定基础。

采用荧光标记抗体对分离株进行抗原性检测结果来看，在细胞浆内可以观察到绿色荧光，这符合BVDVs在感染细胞浆内完成复制生物学特征[15]。采用本试验所建立的免疫荧光试验对分离株XC毒力进行测定，结果为10-5.9TCID50/0.2 mL，但其毒力在牛体致病力如何，有待动物实验进一步研究。

BVDVs亚型分类方法主要依据病毒的5'-UTR、Npro、E2基因进行[16-18]，近3年来流行病学研究显示，BVDVs在我国存在不同亚型。Yifei Lang等[19](2014)也发现，从我国部分地区分离到的毒株存在9种亚型(BVDV-1a，-1b，-1c，-1d，-1o，-1m，-1p，-1q 与 BVDV-2a)。Mingliang Deng等[20](2015)对我国8省临床观察健康的奶牛、肉牛、牦牛、水牛等1 379份血清样品遗传进化分析发现，牛群中主要有 BVDV-1b(33.06%)， BVDV-1m (49.19%)， BVDV-1u (17.74%)等4种亚型。 陈锐等[13](2016)发现，新疆散养肉牛中主要流行BVDV-1q和BVDV-1f，内蒙主要流行BVDV-1m，甘肃流行的是一种新的亚型BVDV-1u。从这些研究报道不难看出，BVD-1m是我国目前主要流行的一种亚型。

本试验为了确定分离株亚型，对分离株5'-UTR、Npro两个基因核苷酸序列构建进化树分析，结果显示，分离株XC的这两种不同基因序列均与BVDV-1m参考株在同一分支。核苷酸同源性分析，发现分离与BVDV-1m参考株的同源型均高于与BVDV-1其他参考株，进一步证实分离株XC属于BVDV-1m亚型。

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IsolationandIdentificationofBovineViralDiarrheaVirusXCStrain

DENG Yu , HE Xue-qian , CHEN Hong-jun , ZHANG Zheng

(School of Animal Sicience, Xichang Colleg, Xichang 615013，China)

A BVDV positive sample was propagated in MDBK cells and a BVDV strain was isolated. In this study, cell culture, direct immunofluorescence assay, RT-PCR and TCID50were applied to identify the isolate, and the bioinformatics software was used to analyze the genetic characteristics. Our results indicated that the strain did not cause cytopathic effect(CPE)until the tenth passage on MDBK cells. This isolate infected MDBK cells and showed strong fluorescent signal by the immunofluorescence assay. DNA fragment of 310 bp and 504 bp were amplified by PCR from 5'-UTR and Nproof this isolate. Virus titer of the isolate was 10-5.9TCID50/0.2mL. The homology comparison and phylogenetic analysis of 5'-UTR and Nprobetween BVDV-1 XC strain and representative BVDVs showed that the isolate was in the same group with BVDV-1m. BVDV-1 XC strain is successfully isolated and belongs to BVDV-1m and has noncytopathic effect.

Bovine viral diarrhea virus ; isolation and identification ; direct immune-fluorescence assay ; noncytopathic

S852.65+3

A

0529-6005(2017)10-0038-04

2017-04-07

四川省教育厅自然科学重点项目(18ZA0523)；四川省科技厅科技支撑项目(2014NZ0113)；攀西动物疫病检测与防控四川省高校重点实验室基本科研业务经费项目(341B)

邓宇(1978-)，男，副教授，博士，主要从事兽医微生物及其分子生物学研究，E-mail：dengyu127@163.com