猪圆环病毒2型ORF3蛋白的表达及抗原性鉴定

刘梦志 ， 陈 欣 ， 金淑秀 ， 张艺凡 ， 蒋佳羲 ， 刘宝山

(沈阳农业大学畜牧兽医学院 ， 辽宁 沈阳 110866)

猪圆环病毒2型ORF3蛋白的表达及抗原性鉴定

刘梦志 ， 陈 欣 ， 金淑秀 ， 张艺凡 ， 蒋佳羲 ， 刘宝山

(沈阳农业大学畜牧兽医学院 ， 辽宁 沈阳 110866)

为研究猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF3蛋白的免疫活性，对其进行了表达及初步鉴定。根据NCBI上PCV-2 ORF3的基因序列(FR823451)设计特异性引物，扩增后将其插入pET28a表达载体构建了重组表达质粒pET-PCV-2-ORF3，转化E.coliBL21(DE3)诱导表达后用SDS-PAGE和免疫印迹进行了鉴定。随后又用圆环病毒野毒感染猪和重组ORF2免疫小鼠的阳性血清对表达蛋白的免疫原性进行了检测。结果表明，构建成功的pET-PCV-2-ORF3表达菌被诱导后能大量表达PCV-2 ORF3蛋白。ORF3表达蛋白能与圆环病毒野毒感染猪的阳性血清发生特异性反应，与重组疫苗免疫鼠的阳性血清不能发生反应，表明ORF3蛋白具有很好的免疫原性和反应原性，有望作为圆环病毒野毒感染检测的靶抗原。

PCV-2 ； ORF3 ； 表达 ； 鉴定

猪圆环病毒病是由猪圆环病毒2型(PCV-2)感染引起的猪传染病，可表现为断奶仔猪多系统衰弱综合征、猪皮炎和肾病综合征、猪呼吸系统衰弱综合征、仔猪传染性先天性震颤等疾病类型，而且还与母猪繁殖障碍、育肥猪炎性呼吸道病综合征(PRDC)及仔猪肠炎有关[1-3]。现已被世界各国的兽医与养猪业者公认为是继猪繁殖与呼吸综合征之后重要的猪传染病[2, 4]。

猪圆环病毒2型属于圆环病毒科、圆环病毒属，为单股负链环状DNA病毒。该科的病毒粒子直径14～25 nm，为20面体对称结构，无囊膜，是已知的最小的动物病毒之一。PCV-2基因组全长为1 767～1 768 bp，含有11个可能的ORFs。PCV-2的2个最主要阅读框是ORF1和ORF2。ORF1基因是PCV中最大的开放阅读框，与病毒的滚环复制相关。ORF1基因全长936 bp (PCV-1)和945 bp (PCV-2)，编码312～314个氨基酸的Rep蛋白，Rep蛋白分子质量约为37 ku。ORF1序列相当保守，是PCV-1和PCV-2产生抗原交叉反应的主要原因[5]；ORF2基因是病毒第二大开放阅读框，是病毒的核衣壳蛋白，全长702 bp，编码233个氨基酸，编码病毒的Cap蛋白，该蛋白相对分子质量约为30；ORF2含有4 个免疫反应点，其中69～83 aa位和117～131 aa位碱基编码的蛋白质对PCV-2抗血清有特异性[5]。

ORF3基因是近年来研究的热点，该基因位于ORF1基因的内部，是除ORF1、ORF2外较大的阅读框，在基因组互补链上的方向与ORF1基因相反，全长由315个核苷酸组成，编码由104个氨基酸组成的非结构蛋白。Liu等采用基因定点突变技术使ORF3基因缺失，并用基因缺失的该病毒进行PK-15细胞感染试验，结果表明，ORF3编码蛋白在培养细胞病毒复制中属非必需蛋白，它是通过诱导细胞凋亡从而在致病性方面发挥作用[6]；进一步分析发现，ORF3蛋白通过与pPirh2反应或干扰p53与pPirh2的连接，而导致PCV-2感染细胞的凋亡[7-8]。

ORF3基因是除 ORF1、ORF2外较大的阅读框，表达蛋白通过诱导细胞凋亡从而在致病性方面发挥作用[9]，其基因的缺失或变异均能减弱 PCV-2的致病。研究还发现，PCV-2 ORF3蛋白可以引起免疫小鼠血清中IL-4的浓度显著升高(Plt;0.05)，而对IL-10、IL-12和INF-γ的浓度没有影响，表明ORF3蛋白在PCV-2诱发的体液免疫中发挥一定的作用[10]。但ORF3刺激机体产生抗体的情况尚未有统一的报道[11-12]，本研究对此进行了研究。

1 材料与试剂

1.1 圆环病毒阳性病料 2份试验所用的圆环病毒DNA由沈阳信科农业技术有限公司提供。

1.2 载体及菌株 试验所用的pET28a原核表达载体和E.coliBL21(DE3)菌株由本实验室保存。

1.3 抗体及试剂 猪圆环病毒野毒感染抗体、重组ORF疫苗免疫小鼠的阳性血清由沈阳信科农业技术有限公司提供；6×His单克隆抗体、HRP标记的蛋白G、IPTG、DAB显色试剂盒、硝酸纤维素膜，均购自上海生工生物工程技术服务有限公司； PremixTaq、质粒小量抽提试剂盒、胶回收试剂盒、T4 DNA连接酶、限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ，均购自宝生物工程(大连)有限公司。其他试剂均为国产。

2 方法和结果

2.1 引物的设计与合成 根据NCBI上发表的猪圆环病毒2型ORF3基因序列(FR823451)，使用分子生物学软件prime premier 5.0设计并合成了1对可以扩增ORF3全长基因的引物。PCVORF3F： 5′-tttt gga tcc ATG GTA ACC ATC CCA CCA C-3′，PCVORF3R：5′-tttt gaa ttc TTA CTT ATT GAA TGT GGA GCT C-3′。为简化试验步骤，引物两端分别设计了保护性碱基和限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位点。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

2.2 圆环病毒2型ORF3基因的PCR扩增 在PCR管中依次加入超纯水2 μL，PremixTaq5 μL、20 mol/L的上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，混匀后短暂离心，进行PCR反应。PCR反应条件：96 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环后，72 ℃再延伸5 min。PCR结束后产物以2%琼脂糖凝胶电泳分析，在250 bp和500 bp的条带中间出现1条扩增条带(图1)，与预期目的片段315 bp相符。

图1 PCV-2 ORF3基因的PCR扩增

2.3 圆环病毒2型ORF3表达载体pET-PCV-2-ORF3的构建 将BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后的特异性扩增片段和pET-28a质粒胶回收后连接并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，37 ℃培养过夜。挑取菌落培养后提取质粒DNA，进行PCR和BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切鉴定。质粒1和2在315 bp处各获得一特异性条带(图2)，说明猪圆环病毒2型ORF3基因已重组到载体中，为阳性克隆。然后将质粒送宝生物工程(大连)有限公司测序，BLAST鉴定为圆环病毒ORF3序列。

图2 PCV-2 ORF3基因的PCR和酶切鉴定

2.4 ORF3重组阳性菌的诱导表达和SDS-PAGE电泳 将鉴定正确的ORF3重组表达菌接种于4 mL含Kan(50g/mL)的LB液体培养基中，37 ℃振荡培养，当其OD600约为0.40.6时，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，诱导表达4 h，然后取1 mL离心收集菌体沉淀。在收集的菌体沉淀中加入SDS-PAGE 上样缓冲溶液100L，震荡混匀后煮沸裂解10 min，离心取上清进行SDS-PAGE电泳。

SDS-PAGE电泳表明，诱导菌在15 ku附近出现大量的蛋白表达，和未诱导菌形成鲜明的对比(图3)，表明蛋白诱导表达成功。

图3 重组ORF3蛋白的SDS-PAGE鉴定

M：蛋白Marker; 1：未诱导菌； 2：诱导菌

2.5 重组ORF3蛋白的免疫印迹鉴定 诱导菌SDS-PAGE电泳后转印于硝酸纤维素膜上，使用1∶100倍稀释的6×His单克隆抗体作为一抗，1∶1 000 倍稀释的HRP标记的羊抗鼠血清作为二抗对重组蛋白进行Western-Blot分析。

Western-Blot结果表明，诱导菌在15 ku的位置上出现了显著的免疫印迹条带(图4)，位置和SDS-PAGE电泳位置相同，表明表达蛋白为ORF3的6×His融合蛋白。

2.6 ORF3与猪阳性血清的免疫反应性测定 分别使用1∶100倍稀释的圆环病毒野毒感染猪的阳性血清和重组ORF2疫苗免疫鼠的血清作为一抗，1∶1 000 倍稀释的HRP标记的蛋白G作为二抗对重组蛋白作Western-Blot分析。

Western-Blot结果表明，用重组ORF2免疫鼠的血清作为一抗时，诱导菌和对照菌在15 ku处没有出现明显的条带差异，表明重组表达的ORF3和血清没有反应(图5A)，免疫鼠的血清中无ORF3抗体；而在使用圆环病毒野毒感染猪的阳性血清作为一抗时，15 ku的附近位置出现了明显的免疫印迹条带(图5B)，而对照菌体未出现可见条带，表明重组ORF3表达蛋白能与野毒感染猪阳性血清发生反应，具有反应原性。同时也间接表明PCV-2的ORF3蛋白能刺激感染动物机体产生相应抗体，具有免疫原性。

图4 6His单抗的免疫印迹鉴定

图5 重组疫苗免疫血清和野毒感染血清的免疫印迹鉴定

A．重组疫苗免疫血清； B. 野毒感染血清M：蛋白Marker; 1：未诱导菌；2：诱导菌

3 讨论

PCV-2包括4个基因亚型，即PCV-2a，PCV-2b，PCV-2c和PCV-2d。我国报道的PCV-2分离毒株的基因型主要是PCV-2a和PCV-2b，其中PCV-2b已成为近年来国内流行范围最广的基因型[13]。

对于PCV-2感染的防控，除了采取综合防治措施外，疫苗免疫接种已经成为病毒污染严重猪场的主要措施。我国市场上批准销售的疫苗有杆状病毒表达的PCV-2 ORF2亚单位疫苗(勃林格殷格翰和英特威/先灵葆雅)、PCV-1-PCV-2嵌合体疫苗(美国富道)和全病毒灭活疫苗(法国梅里亚和国内各疫苗厂家)[14]。但这些商品化疫苗主要针对PCV-2a型病毒，虽对PCV-2b型病毒也产生交叉保护，但不能完全控制PCV-2b型病毒在猪群中的传播[13]。同时，生产中还存在免疫抑制、免疫不当、漏免等情况，造成疫苗免疫猪群中部分猪仍然存在野毒感染的情况，这对于猪场进行圆环病毒的防控和净化非常不利。借鉴伪狂犬的净化经验，要更好地进行圆环病毒的防控和净化，还需要一种在免疫猪群中检测野毒感染猪的手段，以便将野毒感染猪从免疫猪场进行剔除，减少猪场野毒感染的压力，逐步做到PCV-2的净化。然而，现有的商品化PCV-2抗体检测试剂盒均检测ORF2蛋白抗体，而ORF2蛋白在疫苗和野毒中都存在，所以它们不能将疫苗免疫猪和野毒感染猪区分开，不能进行免疫猪群中野毒感染猪的鉴定，只能用来进行非免疫猪群野毒感染的检测及免疫猪群免疫效果的评价。

ORF3基因是PCV-2中除ORF1、ORF2外较大的阅读框，位于基因组671～ 356 bp位碱基( 复制起始点作为序列起始)，共 315 bp，编码104 个氨基酸。研究表明， ORF3 编码蛋白在培养细胞的病毒复制中属非必需蛋白，但可以通过与pPirh2 反应或干扰p53与pPirh2的连接，导致PCV-2感染细胞凋亡，从而在致病性方面发挥作用[9]，ORF3 蛋白的缺失或变异均能减弱PCV-2的致病。其他试验还表明，ORF3( 特别是前50个氨基酸) 在猪感染 PCV-2导致PCVAD 中也起一定的作用。2013年王亚军等报道发现，PCV-2 ORF3蛋白可以引起免疫小鼠血清中IL-4的浓度显著升高(Plt;0.05)，而对IL-10、IL-12和INF-γ的浓度没有影响，表明ORF3蛋白在PCV-2诱发的体液免疫中发挥一定的作用[10]，可以影响病毒衣壳蛋白在机体内的免疫效果。2015年Choi等发现，ORF3蛋白也能促进猪上皮细胞IL-6、IL-8的分泌[15]。但ORF3刺激机体产生抗体的情况尚未有统一的报道，2012年杨晓燕等克隆表达了PCV-2 ORF3蛋白，免疫印迹表明其能够和PCV-2阳性血清发生特异性相互作用[11-12]；而2010年冉旭华等却发现重组ORF3与阳性血清之间没有免疫反应[12]。

为分析PCV-2 ORF3蛋白的免疫原性，本研究对其进行了重组表达和免疫印迹，结果其能与 PCV-2野毒感染猪的阳性血清发生反应，而与重组ORF2疫苗免疫鼠的血清不发生反应，表明其在野毒感染过程中能刺激动物机体产生相应抗体，有望作为野毒感染抗体检测ELISA试剂盒的靶抗原，从ORF2重组疫苗免疫猪群中鉴定出野毒感染猪，便于猪场的圆环病毒净化。

本试验使用野毒感染猪的血清进行表达蛋白的免疫印迹时出现了很多的杂带，应是血清中含有大肠杆菌抗体与重组表达菌的菌体蛋白发生反应所致。

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ExpressionandIdentificationofORF3ProteinofPCV2

LIU Meng-zhi , CHEN Xin , JIN Shu-xiu , ZHANG Yi-fan , JIANG Jia-xi , LIU Bao-shan

(Husbandry and Veterinary Academy, Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866,China)

To study the function of ORF3 protein of PCV2, we expressed it and investigated its immunity activity. After designing a pair of specific primers according to the NCBI PCV2 ORF3 gene sequence, it was amplified and inserted into pET28a expression vector for the construction of the recombinant expression vector pET-PCV2-ORF3. After transforming the vector into E.coli BL21 (DE3), recombinant ORF3 protein was induced to express and its immunity activity was identified with 6his monoclonal antibody and positive serum of wild virus infected pigs by western blot. The results showed that the successful built pET-PCV2-ORF3 expressing bacterium was induced to express ORF3 protein. The rORF3 protein reacted with the positive serum of wild virus infected pigs in western blot, but didn’t react with positive serum of Vaccine-inoculated mice. These suggest that ORF3 protein has good immunogenicity and can be used as aim antigen to differentiate the inoculated pigs and infected pigs in the future.

PCV2 ； ORF3 ； Expression ； Identification

LIU Bao-shan

S855.3

A

0529-6005(2017)10-0055-04

2016-10-19

沈阳农业大学2015年大学生创新训练项目

刘梦志(1992-)，男，硕士生，研究方向为预防兽医学，E-mail：865211615@qq.com

刘宝山，E-mail：liubaoshanl@163.com