鸡源多杀性巴氏杆菌QHP-1株分离鉴定与耐药性分析

常超越 ， 张召兴 ， 李蕴玉 ， 贾青辉 ， 闫艳娟 ， 张香斋 ， 李佩国

(河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室 ， 河北 秦皇岛 066604)

鸡源多杀性巴氏杆菌QHP-1株分离鉴定与耐药性分析

常超越 ， 张召兴 ， 李蕴玉 ， 贾青辉 ， 闫艳娟 ， 张香斋 ， 李佩国

(河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室 ， 河北 秦皇岛 066604)

为了确定引起鸡急性死亡的病原菌，从临床病死鸡体内分离到的一株病原菌，并命名为QHP-1，采用分离培养、纯培养、形态观察、生化试验等鉴定方法，初步鉴定为多杀性巴氏杆菌。经过Kmt1基因序列分析发现，临床分离菌株QHP-1与多杀性巴氏杆菌的同源性为100%。动物回归试验表明，分离的QHP-1株有强的致病性。耐药性分析结果：分离菌株QHP-1对头孢克肟、头孢曲松、强力霉素、恩诺沙星4种药物高度敏感；对氟苯尼考、庆大霉素、阿米卡星3种药物中度敏感；对阿莫西林、氨苄西林、四环素等5种药物耐药。

鸡 ; 多杀性巴氏杆菌 ；Kmt1基因 ； 分离鉴定 ； 药敏试验

2016年10月，秦皇岛市昌黎某一养鸡场，42日龄雏鸡突然发病和突然死亡，多数病鸡呈急性死亡，病鸡出现了嗜睡，精神沉郁、食欲减少或不食、羽毛松乱；有的病鸡出现咳嗽症状、并且口鼻有黏液性分泌物流出，还伴有腹泻症状，有的昏迷痉挛而死亡。对病死鸡进行了剖检，无菌采集病料组织分离鉴定，通过细菌的常规鉴定方法和分子生物鉴定的方法确定了引起成年鸡死亡的病原菌为多杀性巴氏杆菌，对其进行了耐药性分析。

1 材料与方法

1.1 病料来源 秦皇岛昌黎县某养鸡场存栏1万只，发病率为18%，对急性死亡的病鸡进行剖检，记录眼观病理变化。无菌操作采集具有典型病理变化的肝脏、心血、肺脏和脾脏等病料，进行了分离鉴定。

1.2 主要试剂与仪器 血液琼脂基础培养基、普通琼脂培养基、NB营养肉汤，购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；药敏纸片，购自北京天坛药物生物技术开发公司；美蓝染色液试剂盒，购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；微量发酵，购自杭州天和微生物试剂有限公司；ID32E肠道菌鉴定试纸条，购自法国梅里埃公司；琼脂糖、TAE、DL-2 000 Marker、2×TaqMarker Mix，Gold View核酸染液、10×Loading Buffer、树脂型TM基因组DNA提取试剂盒，均购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.3 实验动物 42日龄海蓝褐雏鸡8只，购自秦皇岛市昌黎某鸡场。

1.4 细菌分离纯化 无菌采集的病死鸡的肝脏、心血、肺脏和脾脏等病料组织，划线接种于鲜血琼脂培养基，37 ℃恒温培养12～24 h，选取圆形、透明、露珠样优势生长菌接种划线普通培养基纯化培养后，提取纯化培养后优势菌落接种在营养肉汤培养基中37 ℃、200 r/min恒温震荡培养，并调取纯培养的单菌落涂片，革兰染色，显微镜下观察细菌形态。

1.5 细菌生化特性鉴定 按说明书进行操作，用微量发酵管和自动生化鉴定系统ID32E肠道菌鉴定试纸条进行生化试验。

1.6 细菌基因组DNA的提取与Kmt1基因的PCR检测 将纯化培养过的分离菌株QHP-1接种至营养肉汤培养基中，37 ℃震荡培养12～16 h，按照树脂型TM基因组DNA提取试剂盒说明书进行提取基因组DNA，参照文献[1]多杀性巴氏杆菌的Kmt基因序列设计1对引物，预扩增片段为457 bp，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以基因组DNA为模板进行PCR反应。PCR扩增反应体系(50 μL)：2×TaqMarker Mix 25 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2.0 μL, ddH2O 21μL。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，72 ℃中延伸10 min，共30个循环。取出5 μL扩增产物于1%琼脂糖凝胶中，150 V电泳20 min，观察PCR扩增产物的条带，将DNA回收送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定，测序结果与GenBnak数据库中登录基因序列进行同源性比较分析。

1.7 致病性试验 将雏鸡分为2组，每组4只，第1组为试验组每只雏鸡腹腔注射剂量为0.25 mL(108CFU/mL)；第2组接种等量的营养肉汤作为阴性对照。观察发病及死亡情况，对于死亡的雏鸡剖检，无菌取其肝脏、心血、肺脏等病料组织分离并鉴定。

1.8 药敏试验 按照美国临床检验标准委员会(NCCLS)推荐的标准K-B纸片法进行试验操作和结果判断[7]。挑取单菌落接种于营养肉汤中，37 ℃震荡培养至菌浓度达到0.5麦氏比浊管时，用无菌棉签沾取菌液均匀涂布于平板上，贴上药敏纸片，每个药物做3个重复，置37 ℃培养16～18 h，观察结果。测量抑菌圈直径，求其平均值。

2 结果分析

2.1 病死鸡剖检结果 病死鸡肺充血、出血、水肿；肝脏颜色淡、肿大明显，表面存在大量灰白色坏死点；心冠脂肪及心外膜有大量出血点；有的病死鸡出现腺胃乳头水肿，乳头出血点；小肠黏膜严重出血，肠腔内存在大量黄色的黏液。

2.2 细菌形态特征与培养特性 采集肺脏、肝脏、心血组织经鲜血琼脂平板培养，可见均匀一致的灰白色、圆形、湿润、不溶血的露珠样小菌落，在普通琼脂上生长贫瘠。涂片染色镜检，可见革兰阴性短杆菌，散在或成双，美蓝染色呈典型的两极浓染球杆菌，呈卵圆形，中央不易着色(见图1)。

图1 多杀性巴氏杆菌QHP-1株美蓝染色鉴定结果 (1 000×)

2.3 细菌生化特性鉴定 分离菌株QHP-1能发酵葡萄糖、果糖、d-甘露醇产酸不产气，不发酵麦芽糖、蔗糖、鼠李糖，精氨酸双水解酶阴性，鸟氨酸脱羧酶、接触酶、氧化酶为阳性，吲哚试验为阳性。经ATB自动生化仪鉴定分析系统检测分析，鉴定结果为多杀性巴斯德菌，结果见表1，评定结果合格率为 99.5%。

2.4 多杀性巴氏杆菌Kmt基因的PCR扩增与测序 分离菌株QHP-1，进行多杀性巴氏杆菌种特异性Kmt1基因的 PCR 鉴定，分离菌株QHP-1扩增出大约为457 bp的目的条带(见图2)。将目的片段回收进行测序，测序结果与GenBank DNA序列数据库中已发表的多杀性巴氏杆菌Kmt基因序列同源性为100%，确定了分离菌株QHP-1为多杀性巴氏杆菌。

表1 分离菌株生化特性鉴定结果

+：阳性；-：阴性

图2 多杀性巴氏杆菌QHP-1株Kmt基因的PCR扩增结果

2.5 致病性试验 试验组雏鸡12 h后发病死亡。无菌采集肺脏、肝脏、心血组织等进行分离鉴定，结果显示,所分离菌与QHP-1株一致。对照组4只雏鸡健康存活，表明该菌有致病性。

2.6 药敏试验结果 分离菌株QHP-1对头孢克肟、头孢曲松、强力霉素、恩诺沙星4种药物高度敏感；对氟苯尼考、庆大霉素、阿米卡星3种药物中度敏感；对阿莫西林、氨苄西林、四环素等5种药物耐药。结果见表2。

3 讨论

禽巴氏杆菌病是危害禽类主要的细菌性传染病，该病原为条件致病菌，血清型具有16种，尤其是鸡一旦发病，多数呈急性型，不易控制，相关的灭活疫苗只对相同的血清型有一定的保护率，对其他的血清型效果不明显[3-5]。本试验从病死的雏鸡中分离了1株病原菌QHP-1，通过分离培养、纯培养、形态学观察，生化试验等多种鉴定方法，初步确定分离菌QHP-1为多杀性巴氏杆菌。相关文献报道了Kmt1基因是多杀性巴氏杆菌的特异性基因，利用多杀性巴氏杆菌的Kmt1基因特异性，已经建立多种检测多杀性巴氏杆菌的PCR方法[6-7]。本实验也选用多杀性巴氏杆菌的特异性的Kmt1基因对分离菌株QHP-1进行了PCR检测，与GenBnak数据库中登录Kmt1基因基因序列进行同源性为100%，从分子生物学角度证实了该菌株为多杀性巴氏杆菌。动物回归性试验显示分离菌株QHP-1有很强的致病性。

表2 分离菌株QHP-1药敏试验结果

R：耐药；I：中介；S：敏感

根据多杀性巴氏杆菌病流行特点，更有效的控制手段是免疫接种和药物治疗，应该研制多价多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗、 弱毒疫苗和亚单位疫苗， 以有效的预防该病的发生[8]。本试验13种常用的抗生素对分离菌株QHP-1进行了药敏试验，对头孢克肟、头孢曲松、强力霉素、恩诺沙星4种药物高度敏感；对氟苯尼考、庆大霉素、阿米卡星3种药物中度敏感；对阿莫西林、氨苄西林、四环素等5种药物耐药，说明了分离菌株QHP-1存在很强的耐药性。于成接等[9]报道了从广西地区分离禽巴氏杆菌对环丙沙星、恩诺沙星、四环素等药物敏感；王彩丽等[10]报道了禽巴氏杆菌只对先锋噻肟高度敏感；对其他药物存在很强的耐药性。与本试验结果存在差异性，可能与多杀性巴氏杆菌的血清型、地区有关。因此当养殖场发生疾病时，根据药敏试验结果进行科学用药，降低耐药性，才能获得良好的治疗效果。

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[2] National Committee for Clinical Laboartory Standards, Perfomrance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility test for bacteria isolated from anima1s:approved standard, seconded, NCCLS document M31-A2[J].Wayne,USA，2000,49(21)：105-126.

[3] 李浩,刘阳,李长安.多杀性巴氏杆菌病研究进展[J].畜牧兽医杂志, 2011,30(2):31-33.

[4] 彭金菊,禤敏莹,王冬琴,等,多杀性巴氏杆菌病研究进展[J].中兽医医药杂志,2016,3: 29-31.

[5] 刘红玉,邵周伍林, 李刚,等,一株鹅源巴氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析[J].中国兽医科学,2014,44(02):119-123.

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[8] 颜赟,刁有祥,程彦丽,等,一株鸭源巴氏杆菌强毒株的分离鉴定及致病性研究[J].中兽医科学,2010,40(6): 584-588.

[9] 于成接,丁优玲,华亚峰,等.禽霍乱巴氏杆菌的分离 鉴定与致病性研究[J].中国兽医杂志,2013,49(2): 21-23.

[10] 王彩丽,荣俊,王化俊,等.鸡多杀性巴氏杆菌的鉴定和药物敏感试验[J].湖北农业科学,2010,49(5): 1 162-1 165.

Isolation,IdenticationandDrugresistanceanalysisofPasteurellaMultocidaQHP-1isolatedfromchicken

CHANG Chao-yue , ZHANG Zhao-xing , LI Yun-yu , JIA Qing-hui , YAN Yan-juan , ZHANG Xiang-zhai , LI Pei-guo

(Key Laboratorry of preventive Veterinary Medicine in Heibei Province, Hebei Normal University of Science and Technology, Qinhuangdao 066604, China)

To identify the pathogen which caused serious acute death in chickens，The aim of this study was to identify a suspected pathogenic bacteria isolated from the clinical death cases of chicken, and named QHP-1.The suspected bacteria strain was analyzed by the methods of isolating culture and morphological observation. The results showed that the suspected strain wasP.multocida. TheKmt1gene sequence analysis showed that the homology between clinical isolates QHP-1 and Pasteurella multocida was 100%. The results of the animal regression test showed that the isolated QHP-1 strains had strong pathogenicity. Results of drug susceptibility test indicated that the isolate strain was highly sensitive to spore cefixime,ceftriaxone,doxycycline, enrofloxacin, moderately sensitive to florfenicol, gentamicin, Amikacin; the 5 kinds of drugs were not sensitive to amoxicillin, ampicillin and tetracycline ete.

Chicken ;Pasteurellamultocida;Kmtgene ; Isolation and identification ; Drug sensitivity test

LI Pei-guo

S831

A

0529-6005(2017)10-0048-03

2017-01-10

河北省现代农业产业技术体系蛋鸡产业创新团队岗位(HBCT2013090203)；河北省科技支撑项目(12220412D)

常超越(1990-)，女，硕士生，主要从事动物病原微生物及其防控研究，E-mail：changchaoyue2016@163.com;张召兴(1988-),男，硕士生，主要从事动物病原微生物及其防控研究，E-mail：keshiyjszzx0224@126.com

注：张召兴与常超越对本文具有同等贡献

李佩国，E-mail: lpeiguo@163.com