白细胞介素-8对人肺癌A549细胞放疗敏感性的影响

阮肇扬 应可净 (浙江大学，浙江 杭州 30058)

白细胞介素-8对人肺癌A549细胞放疗敏感性的影响

阮肇扬 应可净1(浙江大学，浙江 杭州 310058)

目的探讨白细胞介素(IL)-8对人肺癌A549细胞放疗敏感性的影响。方法将A549细胞又分为对照组、照射组及IL-8组，IL-8组细胞分为三个亚组(分别用0.1、0.2、0.5 μg/ml IL-8处理)。MTT法检测各组细胞的增殖抑制率(IR)，流式细胞仪检测细胞周期，Western印迹检测Caspase-3、bcl-2及bax表达水平。结果IL-8组细胞的G0/G1及S期细胞比例及bcl-2表达显著高于照射组(P<0.05)，Caspase-3及bax表达水平显著低于照射组(P<0.05)；0.5 μg/ml IL-8处理细胞的IR、细胞周期、Caspase-3、bax及bcl-2表达水平与0.1、0.2 μg/ml IL-8组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论IL-8能够降低A549细胞的放疗敏感性。

白细胞介素(IL)-8；A549细胞；放射治疗；敏感性

2004～2010年中国肺癌死亡分布及趋势分析显示，肺癌仍然是我国死亡率最高的恶性肿瘤〔1〕。老年人是肺癌发病及死亡的高危群体，患者因常合并多种基础疾病，肺癌表现不典型，诊断时已经处于中晚期，部分患者一般状态较差，既使诊断较及时也因不能耐受手术而错失治疗机会〔2,3〕。放射治疗是肺癌临床治疗的重要手段之一，但部分患者对放疗的敏感性较差，尤其以非小细胞肺癌患者多见〔4〕。随着肿瘤免疫的发展，多种细胞因子在肿瘤治疗中的作用引起广泛的注意。既往研究发现，白细胞介素(IL)-8在多种肿瘤细胞(肺癌、肝癌及乳腺癌等)的增殖及转移中发挥重要作用〔5〕。但目前关于IL-8对肺癌患者放疗敏感性的研究较少，本研究旨在探讨IL-8对人肺癌A549细胞放疗敏感性的影响。

1 材料及方法

1.1细胞 人肺癌A549细胞株由浙江大学提供。

1.2主要试剂及仪器 试剂：IL-8 1640培养液及胎牛血清(Gibco公司，美国)；噻唑蓝(MTT)及二甲基亚砜(DMSO，Sigma公司，美国)；碘化丙啶(PI，上海翊圣生物科技有限公司)；Gel DoxTM XR+凝胶成像系统(BIO-RAD公司，美国)；Caspase-3，bcl-2、bax及β-actin抗体、BCA定量及Western印迹试剂(Invitrogen公司，美国)。仪器：FCC-7000型同中心回转式60Co治疗机(山东新华医疗器械股份公司)；超净无菌工作台(Spetec公司，德国)；细胞培养箱(Thermo公司，美国)，低速离心机(Beckman Coulter公司，美国)；倒置荧光显微镜(OLYMPUS公司，日本)；酶标仪(Biotek公司，美国)，thermo fisher流式细胞仪(Thermo公司，美国)。

1.3实验方法

1.3.1细胞培养 按3×105个细胞/ml的密度将细胞悬液接种于96孔板培养，1 ml/孔，置于37℃，5%CO2培养箱中恒温培养，待细胞面积生长至70%～80%后传代。

1.3.2细胞分组及处理 将所有细胞分为三组：对照组、IL-8组及照射组。对照组不进行进行特殊处理，IL-8组细胞分为三个亚组，分别在培养基中加入不同浓度IL-8(0.1、0.2、0.5 μg/ml)，每一组细胞设置6个复孔，IL-8组及照射组均接受X射线照射：在96孔板上加盖1.5 cm的有机玻璃，置于室温下，采用6 MV的射线处理，源皮距为100 cm，照射剂量为2 Gy(200 cGy/min)。

1.3.3细胞增殖抑制率(IR)检测 分别于24、48、72 h采用MTT检测A549细胞的情况：各组细胞处理完后去除培养基，加入RPMI1640培养液100 μl/孔及含0.5%MTT的培养液(5 μl/孔)，于37℃、5%CO2培养箱中孵育4 h后弃培养液，加入100 μl DMSO原液，振荡10 min，待结晶完全溶解后用酶标仪于490 nm波长处测定吸光值(OD值)，实验重复3次，IR=(1-OD处理/OD对照)×100.00%。观察不同浓度的IL-8对IR的影响。

1.3.4检测细胞周期变化 取对数生长期的细胞，制备细胞密度为3×105个/ml的单细胞悬液，将1 ml的细胞悬液置于6孔板中，细胞的分组及处理方式同1.3.2。将各组细胞于37℃、5%CO2孵育箱中培养72 h后进行细胞周期检测：去除上清液，每孔加入0.3 ml的0.25%胰蛋白酶消化120 s，收获细胞。用4℃的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，置于70%的冷乙醇溶液中固定过夜，PI染色30 min后采用流式细胞仪检测细胞周期，计算G0/G1、G2+M期和S期细胞所占的比例。

1.3.5Western印迹检测Caspase-3，bcl-2及bax表达水平变化 24 h后，Western印迹检测对照组、IL-8组及照射组Caspase-3、bcl-2及bax表达水平。按照说明书用蛋白裂解液(含磷酸酶抑制剂)裂解30～60 min，4℃，12 000 r/min离心5 min获取总蛋白，BCA法测浓度后各取30 μg蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳，100 V恒压转膜60～90 min；5%脱脂奶粉/TBST室温封闭1～2 h，Caspase-3、bcl-2及bax(稀释倍数1∶1 000)抗体4℃孵育过夜；1∶5 000 β-actin室温孵育1.5 h，TBST洗膜10 min×3次，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔/鼠二抗室温孵育2 h，TBST洗膜10 min×2次，TBS洗膜5 min，电化学发光法(ECL)发光试剂盒色，显影，Gel Doxtm XR+凝胶成像系统成像，图像分析采用Quantity One软件，取各条带透光体积与内参条带的比值作为目标蛋白相对表达量，实验重复3次。

2 结 果

2.1各组细胞不同时刻的IR比较 对照组各时点IR均为0。与照射组相比，不同浓度IL-8处理细胞的抑制率显著降低(P<0.05)。0.5 μg/ml IL-8组细胞的抑制率低于0.2 μg/ml、0.1 μg/ml，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组细胞的IR比较

与照射组比较：1)P<0.05；与0.5 μg/ml组比较：2)P<0.05

2.2各组细胞的细胞周期比较 与对照组相比，照射组细胞的G0/G1及S期细胞比例显著降低，G2+M期细胞比例显著增多(P<0.05)。不同浓度的IL-8处理后，细胞的G0/G1及S期细胞比例显著高于照射组，G2+M期细胞比例低于照射组(P<0.05)；0.5 μg/ml IL-8组细胞的G0/G1及S期细胞比例高于0.2、0.1 μg/ml组，G2+M期细胞比例低于0.2、0.1 μg/ml组(P<0.05)，见表2。

2.3各组细胞的Caspase-3、bcl-2及bax表达水平变化 与对照组相比，照射组细胞的Caspase-3及bax表达水平显著升高，bcl-2表达水平显著降低(P<0.05)。不同浓度IL-8处理后，细胞的Caspase-3及bax表达水平低于照射组，bcl-2表达水平高于照射组(P<0.05)。0.5 μg/mlg IL-8组bcl-2水平明显高于0.2、0.1 μg/ml组，0.5 μg/ml IL-8组Caspase-3及bax水平低于0.2、0.1 μg/ml组，差异均具有统计学意义(P<0.05)，见图1。

表2 各组细胞的细胞周期比较

与照射组比较：1)P<0.05

与对照组相比：1)P<0.05；与照射组相比：2)P<0.05；与IL-8 0.5 μg/ml组比较：3)P<0.05图1 各组细胞的caspase-3、bcl-2及bax表达水平变化

3 讨 论

付宝红等〔6〕研究发现，血清IL-8与老年非小细胞肺癌患者放疗效果具有明显的相关性。本研究提示放疗能够抑制A549细胞的DNA合成作用，阻止细胞周期从G1期到S期的转化过程〔7〕。bcl-2定位于线粒体外膜，能够通过多种机制发挥抗细胞凋亡的作用；bax蛋白多以非活性的单体形式分布于胞质中,只有在接收到凋亡信号刺激被激活后发生分子构象改变,移位并插入线粒体外膜后形成bax大孔道,破坏线粒体膜的完整性,并与bcl-2等抑制凋亡的蛋白对抗,阻止其抗凋亡作用。Caspase-3作为Caspase级联下游最关键的凋亡执行者,其激活在很大程度上依赖cyt-c的释放,而bcl-2家族中的bcl-2、bax基因可通过线粒体途径介导cyt-c等物质的释放。近年来研究发现，bcl-2、bax可作为Caspase-3的上游调控机制,参与对Caspase-3激活和与之相关的细胞凋亡途径的调节〔8～10〕。本研究结果说明放射治疗能够明显抑制A549细胞的增殖，促进其凋亡。

A549细胞为非小细胞肺癌细胞系。临床上，部分非小细胞肺癌患者放疗效果不佳。肿瘤放疗的敏感性与多种因素相关，本次研究中细胞均在对数期接受处理，增殖活跃的细胞对射线敏感性优于增殖较慢的细胞；且离体培养细胞呈贴壁生长，与射线接触较为充分，故非小细胞肺癌细胞系放疗的敏感性较好〔11,12〕。

不同浓度的IL-8呈时间-剂量依赖效应降低射线对A549细胞增殖的抑制作用。上述研究说明IL-8能够降低人肺癌A549细胞对放疗的敏感性。IL-8作为常见的细胞趋化因子，不仅能促进中性粒细胞、白细胞及血管内皮细胞的迁移，在肿瘤细胞的浸润及转移中也发挥重要作用〔13〕。既往研究发现，肺癌患者血清中的IL-8水平显著高于正常人群，患者IL-8水平与肿瘤血管密度、病理分型及临床分期具有重要相关性，IL-8与肿瘤细胞表面特异性受体结合，激活下游信号分子，发挥促进肿瘤细胞增殖及血管新生的作用。但IL-8影响肿瘤细胞放疗敏感性的具体机制有待于更加深入的研究〔14,15〕。

综上所述，IL-8能够降低A549细胞的放疗敏感性，且呈剂量依赖效应。

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R734.2

A

1005-9202(2017)24-6011-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.003

1 浙江大学医学院附属邵逸夫医院呼吸内科

阮肇扬(1979-)，男，主治医师，主要从事呼吸系统疾病研究。

〔2017-07-13修回〕

(编辑 李相军)