缺氧诱导因子-2α对基质金属蛋白酶-2启动子活性的转录调控作用

李 娜 梁文辉 史 齐 王建强 王志慧 (新乡医学院,河南 新乡 453003)

缺氧诱导因子-2α对基质金属蛋白酶-2启动子活性的转录调控作用

李 娜 梁文辉1史 齐 王建强 王志慧 (新乡医学院,河南 新乡 453003)

目的克隆基质金属蛋白酶(MMP)-2基因5′上游1.7 kb启动子，构建启动子-萤光素酶报告基因载体pGL3-MMP-2 pro，探讨缺氧诱导因子(HIF)-2α对MMP-2启动子转录活性的影响。方法采用PCR扩增MMP-2启动子上游区域基因片段，插入到含有萤光素酶报告基因的载体PGL3-basic中构建重组子，经双酶切和测序鉴定后，将重组子转染MCF-7细胞，通过双萤光素酶活性分析HIF-2α对MMP-2启动子转录活性的影响。结果PCR扩增的1.7 kb片段经测序正确无误，pGL3-MMP-2 pro转染MCF-7细胞48 h后，双萤光素酶活性测定结果显示加CoCl2诱导的pGL3-MMP-2 pro +HIF-2α组启动子活性显著高于pGL3-MMP-2 pro组、阴性对照组和空白对照组(均P<0.05)。结论HIF-2α促进了MMP-2启动子转录活性。

缺氧诱导因子-2α；基质金属蛋白酶-2；启动子；MCF-7细胞

缺氧诱导因子(HIF)-2是调节氧稳态的核心转录因子，在肿瘤形成和发展中发挥重要作用。基质金属蛋白酶(MMP)-2，又称Ⅳ型胶原酶或明胶酶，在恶性肿瘤的侵袭转移及间质血管生成过程中起重要作用〔1〕。关于恶性肿瘤中HIF-2α与MMP-2表达的关系及MMP-2是否为HIF-2α促进细胞侵袭、转移的作用靶点，目前相关报道较少。我们的前期研究发现HIF-2α的表达与乳腺癌的侵袭转移之间存在明显相关性，并且HIF-2α能够上调MMP-2的表达〔2，3〕。本研究在构建MMP-2启动子报告载体基础上，探讨乳腺癌细胞中HIF-2α对MMP-2启动子转录活性的影响。

1 材料与方法

1.1材料 pMD18-T载体购自大连宝生物工程有限公司，HIF-2α单克隆抗体购自福州迈新生物技术开发有限公司(Neomarkers产品)，人成纤维细胞(NIH3T3)和乳腺癌细胞(MCF-7)购于中科院上海细胞库；pGL3-basic萤光素酶报告基因系统来自Promega公司。

1.2PCR扩增MMP-2 pro cDNA 根据文献报道〔4〕，设计MMP-2 pro引物序列，上游：5′-ATGTCTGGTACCACACCCACCAGACAAGCCT-3'；下游：5'-ATAGTACTCGAG AAGCCCCAGATGCGC AGCCT-3'，交上海生工生物技术有限公司合成，LA Tag酶PCR扩增 MMP-2 pro cDNA。

1.3pMD18-T-MMP-2 pro的构建 酚氯仿抽提MMP-2 pro cDNA PCR扩增产物，将纯化回收的 MMP-2 pro cDNA连接到pMD18-T上，EcoRv为pMD18-T上的克隆点，转化DH5α感受态大肠杆菌，经氨苄青霉素进行抗性筛选，挑选单克隆扩增，提取质粒，Kpn I/Xho Ⅰ双酶切鉴定。将鉴定连接成功的质粒菌液送上海生工生物技术有限公司进行测序。

1.4pGL3-MMP-2 pro载体构建 用限制性内切酶Kpn Ⅰ/Xho Ⅰ双酶切pMD18-T-MMP-2 pro，切取约1.7kb片段，Kpn Ⅰ/Xho Ⅰ进行双酶切质粒pGL3-basic，将纯化回收的MMP-2 pro cDNA克隆于pGL3-basic的Kpn Ⅰ/Xho Ⅰ之间。转化DH5α感受态大肠杆菌，经氨苄青霉素进行抗性筛选，挑选单克隆扩增，提取质粒，进行酶切鉴定。将鉴定连接成功的质粒菌液送上海生工生物技术有限公司进行测序。

1.5乳腺癌MCF-7细胞的培养和转染 采用脂质体转染法(Promega)，将乳腺癌MCF-7细胞分别以5×103个细胞/孔接种于6孔板中，37℃，5%CO2培养箱中孵育过夜，至细胞密度长至60%～80%，吸去DMEM+10%FBS培养液，DMEM培养液清洗，1 ml DNA/脂质体复合物加入每孔，37℃5%CO2培养箱中温育1 h，2 ml 10%FBS DMEM培养液加入每孔，37℃，5%CO2培养箱中孵育。

1.6双萤光素酶活性测定 按照萤光素酶检测系统(Promega)说明进行，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗转染48 h后的细胞，每孔加入300 μl 1倍裂解液，将50 μl萤光素酶试剂Ⅱ加入到1.5 ml EP管中，取10 μl 细胞裂解液加入上述EP管中，吹打混匀，置于检测仪测定pGL3中的萤光素酶活性及内参海肾萤光素酶活性。二者比值为被检测质粒转染细胞后所测得的萤光素酶相对活性。分组如下：①未转染的MCF-7细胞(空白对照组)；②只转染pGL3质粒的MCF-7细胞(阴性对照组)；③只转染pGL3-MMP-2 pro质粒的MCF-7细胞；④CoCl2处理的转染pGL3-MMP-2 pro质粒的MCF-7细胞。以pGL3-MMP-2 pro的活性作为100%，各组重复测3次。

1.7统计学方法 采用SPSS13.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1PCR扩增 MMP-2 pro cDNA 采用PCR方法扩增出MMP-2 pro cDNA序列，将扩增的 MMP-2 pro cDNA基因PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析，电泳图谱见图1，可见一长约1.7 kb清晰条带，其基因片段大小与预计相符，表明已获得MMP-2 5′启动子非编码区基因片段。

2.2MMP-2 pro cDNA连接到pMD-18T载体 将经LA Tag酶扩增后纯化的MMP-2 pro cDNA基因PCR产物连接到pMD-18T载体上，经限制性内切酶Kpn I/Xho I双酶切鉴定。分别切出一长约1.7 kb条带和一长约2 692 bp条带。电泳图谱见图2，上述酶切鉴定成功的质粒送上海生工生物技术有限公司进行测序，结果完全正确，未发现突变碱基。

M：DNA Marker；1：MMP-2 pro cDNA,下图同图1 PCR扩增MMP-2 pro cDNA

图2 MMP-2 pro cDNA片段连接到T载体后Kpn I/Xho I双酶切鉴定

2.3pGL3-MMP-2 pro cDNA载体构建 采用限制性内切酶Kpn I/Xho I双酶切pMD-18T-MMP-2 pro cDNA，MMP-2 pro cDNA片段经电泳凝胶回收，将其克隆到pGL3的Kpn I/Xho I酶切位点之间。Kpn I/Xho I双酶切后可得到约1.7 kb和4 818 bp的两个条带(见图3)，说明连接成功。

2.4萤光素酶活性分析 以完整MMP-2启动子的活性为100，各组启动子活性比较结果显示：加CoCl2诱导HIF-2α高表达的pGL3-MMP-2 pro +HIF-2α组启动子活性为136±0.866，显著高于pGL3-MMP-2 pro组(100±0.765,P<0.05)、阴性对照组(37±0.565，P<0.01)和空白对照组(21±0.365，P<0.01)，提示HIF-2α增强了MMP-2启动子的转录活性。

图3 重组pGL3-MMP-2 pro cDNA鉴定

3 讨 论

低氧微环境是大多数实体瘤的重要特征，低氧微环境可通过调控多种基因表达而促进肿瘤的发生发展，尽管这些过程是由多种信号通路共同调控的〔5〕，其中HIFs在这一过程中发挥重要作用。HIFs是由HIF-α和HIF-β亚基组成的异二聚体。目前发现的哺乳动物中有三种HIF-α亚基：HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α，均可与HIF-β亚单位结合〔6〕。随着载体构建、基因转染技术、基因沉默实验等多项精细实验方法的使用及研究的不断深入，近期有许多关于HIF这一调节系统的最新发现，研究发现HIF-2α的靶基因涉及能量代谢、儿茶酚胺合成、铁代谢、骨髓造血、血管生长和血管收缩等方面〔7〕。HIF-2被激活后可作用于一系列的靶基因，这些靶基因的启动子或增强子中均含有1个小于100 bp的缺氧反应元件(HRE)，其核心序列为5′-ACGTGCT-3′，是HIF-2与其结合的标识序列，HIF-2与靶基因HRE上HIF-2的结合位点结合成转录起始复合物从而启动靶基因的转录〔8〕。MMP-2在恶性肿瘤的侵袭转移及间质血管生成过程中起重要作用〔9〕。在人体内至少有三种调控机制可能影响MMP-2的活化，包括：转录水平调控，MMP-2蛋白的活化及金属蛋白酶的组织抑制因子，其中基因转录水平调控失调是肿瘤相关基因表达异常的常见机制之一〔10〕。研究发现在胃癌中HIF-2α上调了MMP-2的表达并促进了胃癌的侵袭和转移〔11〕。本文成功构建了人MMP-2启动子萤光素酶报告基因，并在细胞内证明了HIF-2α能够增强MMP-2启动子的转录活性。

1Lotfi A，Mohammadi G，Saniee L，etal.Serum level of matrix metalloproteinase-2 and-9 in patients with laryngeal squamous cell carcinoma and clinical significance 〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev，2015；16(15)：6749-51.

2Wang HX，Qin C，Han FY，etal.HIF-2α as a prognostic marker for breast cancer progression and patient survival 〔J〕.Genet Mol Res，2014；13(2)：2817-26.

3李 娜，王洪兴，张 洁，等.siRNA干扰缺氧诱导因子-2α对乳腺癌细胞增殖能力的影响〔J〕.临床与实验病理学杂志，2014；30(1)：6-9.

4Bian J，Sun Y.Transcriptional activation by p53 of the human type Ⅳ collagenase (gelatinase A or matrix metalloproteinase 2) promoter 〔J〕.Mol Cell Biol，1997；17(11)：6330-8.

5Sandlund J，Ljungberg B，Wikström P，etal.Hypoxia-inducible factor-2 alpha mRNA expression in human renal cell carcinoma 〔J〕.Acta Oncol，2009；48(6)：909-14.

6Fan Y，Li H，Ma X，etal.Prognostic significance of hypoxia-inducible factor expression in renal cell carcinoma：a PRISMA-compliant systematic review and meta-analysis 〔J〕.Medicine (Baltimore)，2015；94(38)：e1646.

7Shin DH，Dier U，Melendez JA，etal.Regulation of MMP-1 expression in response to hypoxia is dependent on the intracellular redox status of metastatic bladder cancer cells 〔J〕.Biochim Biophys Acta，2015；1852(12)：2593-602.

8Amelio I，Melino G.The p53 family and the hypoxia-inducible factors (HIFs)：determinants of cancer progression 〔J〕.Trends Biochem Sci，2015；40(8)：425-34.

9Lotfi A，Mohammadi G，Saniee L，etal.Serum level of matrix metalloproteinase-2 and-9 in patients with laryngeal squamous cell carcinoma and clinical significance〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev，2015；16(15)：674967-71.

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11Tong WW，Tong GH，Chen XX，etal.HIF2α is associated with poor prognosis and affects the expression levels of survivin and cyclin D1 in gastric carcinoma 〔J〕.Int J Oncol，2015；46(1)：233-42.

R73-37

A

1005-9202(2017)24-6041-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.016

河南省自然科学基金面上项目(16230041220)；河南省高校青年骨干教师资助项目(2012GGJS-136)；新乡医学院联合培育基金资助项目(2014QN113)；河南省教育厅高等学校重点科研项目(16A310002)；河南省卫生厅医学科技攻关项目(201403133)

1 新乡市中心医院

李 娜(1977-)，女，博士，副教授，主要从事恶性肿瘤分子病理学研究。

〔2016-10-27修回〕

(编辑 曹梦园)