信号传导及转录激活因子3基因在老年甲状腺癌组织中的表达及基因沉默对甲状腺癌细胞的影响

尤鸣达 李岩冰 张春英 (河北医科大学附属唐山工人医院头颈外科，河北 唐山 063000)

信号传导及转录激活因子3基因在老年甲状腺癌组织中的表达及基因沉默对甲状腺癌细胞的影响

尤鸣达 李岩冰 张春英 (河北医科大学附属唐山工人医院头颈外科，河北 唐山 063000)

目的观察信号传导及转录激活因子(STAT)3基因在老年甲状腺癌组织中的表达及沉默STAT3基因对甲状腺癌细胞的影响。方法将FTC-133细胞分为siRNA STAT3组、阴性对照组和空白对照组，RT-PCR测定FTC-133细胞STAT3、基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9 mRNA的表达，Western印迹测定甲状腺癌FTC-133细胞STAT3蛋白的表达，MTT法测定甲状腺癌FTC-133细胞的生长，Transwell法检测FTC-133细胞的迁移能力。结果老年甲状腺癌组织中STAT3阳性率高于癌旁组织(P<0.05)。siRNA STAT3组FTC-133细胞中STAT3蛋白的表达量低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05)。siRNA STAT3组FTC-133细胞中STAT3、MMP2、MMP9 mRNA的表达量低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05)。siRNA STAT3组第1、2、3天的抑制率均明显高于阴性对照组(P<0.05)。siRNA STAT3组FTC-133细胞中穿膜细胞数低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05)。结论老年甲状腺癌组织中STAT3呈高表达，沉默STAT3基因对甲状腺癌细胞株的增殖和侵袭能力有抑制作用。

信号传导及转录激活因子3；甲状腺癌；基因沉默

高分化的甲状腺癌多数能够通过手术治疗、碘131内放射治疗等取得比较好的效果，但部分患者出现失分化，其转移灶的摄碘能力丧失或者降低。失分化的甲状腺癌细胞转移速度比较快，侵袭力比较强，是甲状腺癌预后的重要影响因素。因低分化或者失分化的甲状腺癌不能进行常规的联合治疗，新兴的生物治疗对低分化或者失分化的甲状腺癌可能具有重要意义〔1，2〕。肿瘤的发生和多种因素有关，抑癌基因、癌基因、凋亡相关基因、细胞周期调控因子、血管生长因子等都和肿瘤的发生发展关系密切，甲状腺癌基因领域的研究有酪氨酸激酶受体基因的重排、BRAF基因突变、Ras基因点突变等〔3，4〕。信号传导及转录激活因子(STAT3)与多种肿瘤关系密切〔5，6〕，与甲状腺癌的发生发展也有一定关系，在甲状腺癌组织中呈高表达〔7～9〕。本文对老年甲状腺癌组织中STAT3的表达情况进行研究，并观察基因沉默STAT3对甲状腺癌细胞增殖及侵袭能力的影响。

1 资料与方法

1.1临床资料 选择唐山工人医院2014年6月至2016年6月老年甲状腺乳头状癌组织40例及癌旁组织40例，女29例，男11例；年龄(67.23±6.32)岁；有淋巴结转移30例，无淋巴结转移10例；TNM分期Ⅰ期21例，Ⅱ期5例，Ⅲ期14例；40例患者均经病理证实为甲状腺癌，均为甲状腺首次手术患者，手术前未进行放化疗及免疫治疗。

1.2主要试剂 甲状腺癌FTC-133细胞株(上海生命科学研究院)，兔抗人STAT3多克隆抗体、兔抗人β-actin多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，RT-PCR试剂盒、MTT试剂盒、Transwell小室(美国Corning公司)等。

1.3方法

1.3.1老年甲状腺癌及癌旁组织中STAT3表达 取甲状腺癌及癌旁组织石蜡标本切成厚5 μm切片，采用免疫组化法测定STAT3的表达情况，一抗为兔抗人STAT3多克隆抗体，阴性对照为磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗，胞质内出现棕黄色颗粒为STAT3阳性细胞。

1.3.2FTC-133细胞分组及转染 将生长良好的FTC-133细胞分为siRNA STAT3组、阴性对照组和空白对照组，接种到24孔板中培养至细胞达85%以上融合时，加入siRNA/lipofectamin复合物，siRNA STAT3组转染STAT3-siRNA/lipofectamin复合物，阴性对照组转染阴性对照siRNA/lipofectamin复合物，空白对照组未进行转染，培养24 h收集细胞。

1.3.3FTC-133细胞STAT3、基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9 mRNA检测 采用RT-PCR法测定目的基因和内参基因β-actin的积分光密度值，目的基因的相对表达量=目的基因积分光密度值/β-actin的积分光密度值，实验重复7次，取平均值。

1.3.4FTC-133细胞STAT3蛋白检测 采用Western印迹检测FTC-133细胞STAT3蛋白表达量，STAT3蛋白的相对表达量=STAT3光密度值/β-actin的光密度值，实验重复8次，取平均值。

1.3.5FTC-133细胞增殖检测 采用MTT法检测FTC-133细胞的增殖，酶标仪测定550 nm波长处光密度值，计算细胞抑制率，细胞抑制率=(空白对照组的光密度值-实验组的光密度值)/空白对照组的光密度值。

1.3.6FTC-133细胞迁移能力检测 采用Transwell法检测各组细胞的迁移能力，取7个高倍视野计数侵袭细胞数，每组7个复孔，取平均值作为穿膜细胞数。

1.4统计学方法 采用SPSS20.0软件，率的比较采用χ2检验，多组均数间比较采用方差分析，组内均数两两比较采用LSD检验。

2 结 果

2.1STAT3在老年甲状腺癌及癌旁组织中的表达 在老年甲状腺癌细胞中，STAT3阳性产物主要定位在细胞质中，甲状腺癌组织中STAT3阳性率为72.5%，明显高于癌旁组织中STAT3阳性率7.5%(χ2=35.208，P<0.05)。

2.2甲状腺癌FTC-133细胞中STAT3蛋白的表达情况 siRNA STAT3组FTC-133细胞中STAT3蛋白的表达量(0.214±0.034)低于阴性对照组(0.397±0.042)和空白对照组(0.409±0.043)(P<0.05)，阴性对照组和空白对照组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3甲状腺癌FTC-133细胞中STAT3 mRNA的表达情况 siRNA STAT3组甲状腺癌FTC-133细胞中STAT3 mRNA的表达量(0.112±0.022)低于阴性对照组(0.188±0.079)和空白对照组(0.205±0.043)(P<0.05)，阴性对照组和空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4siRNA STAT3对甲状腺癌FTC-133细胞生长的影响 siRNA STAT3组第1、2、3天的抑制率分别为(15.55±1.12)%、(59.92±6.88)%、(54.46±7.89)%，阴性对照组分别为(3.43±0.77)%、(12.08±3.35)%、(8.15±1.56)%；siRNA STAT3组第1、2、3天的抑制率均明显高于阴性对照组(P<0.05)。

2.5siRNA STAT3对甲状腺癌FTC-133细胞侵袭力的影响 siRNA STAT3组FTC-133细胞中穿膜细胞数(114.8±16.5)低于阴性对照组(156.9±6.7)和空白对照组(166.7±11.4)(P<0.05)，阴性对照组和空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.6siRNA STAT3对甲状腺癌FTC-133细胞MMP2、MMP9 mRNA的影响 siRNA STAT3组FTC-133细胞MMP2、MMP9 mRNA水平低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05)，阴性对照组和空白对照组MMP2、MMP9 mRNA水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 siRNA STAT3对FTC-133细胞MMP2、MMP9 mRNA的影响

与siRNA STAT3组比较：1)P<0.05

3 讨 论

STAT3是STATs家族成员之一，在维持胚胎干细胞多能性中发挥重要作用。STAT3基因的过度激活或者过度表达能够抵抗细胞凋亡，促进细胞无限生长，促使细胞发生癌变，过度激活的STAT3能够进入细胞核，与靶基因DNA特异性结合，调节MMP2、MMP9、cMyc等基因的表达，参与肿瘤细胞生长存活的调控。钟宝元等〔10〕研究发现结直肠癌组织中STAT3阳性表达率增加；STAT3与结直肠癌的浸润深度、肿瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴结转移等有关；STAT3可能通过抑制E-cadherin促进结直肠癌的发生发展。有研究发现STAT3和甲状腺癌的关系也比较密切〔11，12〕，黄隽等〔13〕研究发现STAT3在甲状腺癌组织中的表达增加，与甲状腺癌组织分化、AJCC分期、淋巴结转移关系密切；汪永旭等〔14〕研究发现STAT3在甲状腺癌组织中表达增加，和甲状腺癌患者的年龄、包膜侵犯、肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移等有关。本研究结果也表明，STAT3和老年甲状腺癌的发生发展关系密切。

RNA干扰技术是一种高效、快捷、经济的特异基因表达抑制技术，在基因表达调控的研究中被广泛应用，在恶性肿瘤的研究中也被广泛应用。本文采用RNA干扰技术沉默STAT3基因，发现RNA干扰技术可以有效抑制甲状腺癌细胞中STAT3基因的过度表达，对甲状腺癌细胞的增殖和侵袭能力有一定抑制作用，能够降低甲状腺癌细胞中MMP2 和MMP9的表达。STAT3有希望成为甲状腺癌基因治疗的靶点。MMP2 和MMP9能够增强肿瘤细胞对细胞外基质和基底膜的降解能力，改变细胞和细胞外基质以及细胞和细胞之间的黏附能力，促进肿瘤内新生血管的形成和内皮细胞的迁移。沉默STAT3基因对甲状腺癌细胞侵袭力的抑制作用可能与其抑制MMP2 和MMP9的表达有关。

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R73

A

1005-9202(2017)24-6017-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.005

尤鸣达(1973-)，男，硕士，主治医师，主要从事头颈外科肿瘤方面研究。

〔2017-01-15修回〕

(编辑 徐 杰)