硫辛酸对帕金森病大鼠黑质多巴胺能神经细胞及炎症因子的影响

鲁 峻 王小林 降建新 刘小星 (泰州市人民医院神经外科，江苏 泰州 225300)

硫辛酸对帕金森病大鼠黑质多巴胺能神经细胞及炎症因子的影响

鲁 峻 王小林 降建新 刘小星 (泰州市人民医院神经外科，江苏 泰州 225300)

目的探讨硫辛酸(LA)对帕金森病(PD)大鼠黑质多巴胺能神经细胞及炎症因子的影响。方法选取无特定病原体的Wistar大鼠36只，将其按照随机数字表法分成对照组、模型组、LA组各12只，对照组大鼠给予背部皮下注射1 ml/kg的葵花油，模型组、LA组给予注射2 mg·kg-1·d-1的鱼藤酮，LA组注射鱼藤酮前30 min给予腹腔注射20 mg·kg-1·d-1的LA，均为1 次/d，共注射30 d。观察各组大鼠在建模期间的活动量、食欲、步态、毛色等一般状态。检测各组大鼠黑质和纹状体内的酪氨酸羟化酶(TH)含量，对比各组大鼠的黑质TH/β-actin值、纹状体TH/β-actin值，同时检测并对比各组大鼠黑质区域的肿瘤坏死因子(TNF)-α光密度值、白介素(IL)-1β光密度值以及纹状体的丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)水平。结果对照组黑质TH/β-actin值、纹状体TH/β-actin值显著高于模型组和LA组(P<0.05)；LA组黑质TH/β-actin值、纹状体TH/β-actin值显著高于模型组(P<0.05)；对照组黑质区域TNF-α和IL-1β的光密度值显著低于模型组和LA组(P<0.05)；LA组黑质区域TNF-α和IL-1β的光密度值显著低于模型组(P<0.05)。对照组纹状体MDA水平显著低于模型组和LA组(P<0.05)，LA组纹状体MDA水平显著低于模型组(P<0.05)；对照组纹状体GSH水平显著高于模型组和LA组(P<0.05)，LA组纹状体GSH水平显著高于模型组(P<0.05)。结论LA能有效改善PD大鼠的疾病症状，同时能保护PD大鼠黑质多巴胺能神经细胞，抑制炎症反应，减轻氧化应激反应，LA可作为研究PD治疗药物新的切入点。

硫辛酸；帕金森病；神经细胞；炎症因子

帕金森病(PD)是一种多发于中老年人群的神经系统退行性疾病，主要的病理变化为中脑黑质多巴胺能神经元出现变性坏死，由此引起黑质纹状体通路遭受破坏，同时降低了壳核、尾状核中多巴胺的含量〔1〕。PD患者主要临床症状为运动迟缓、静止性震颤、姿势步态障碍以及肌强直。已知PD多巴胺能神经元的变性死亡过程与遗传因素、年龄、环境因素、氧化应激等因素相关〔2〕。目前临床上治疗PD的主要手段是药物治疗，患者处于疾病早期时常用B型单胺氧化酶(MAO-B)抑制剂、多巴胺受体(DR)激动剂或金刚烷胺/抗胆碱能药物进行治疗，患者处于疾病中期时上述药物对病情的控制效果一般，需要加大剂量，剂量的增加导致药物的不良反应也较多，同时对于晚期的患者，上述药物的治疗效果较差。硫辛酸(LA)是一种类似维他命的辅酶，主要存在于线粒体内，LA兼具脂溶性与水溶性，能在短时间内到达任何一个细胞部位，且LA具有抑制自由基生成、抗氧化、抗炎的作用，以上特点均有利于改善PD患者的临床症状〔3〕。本研究旨在探讨LA对PD大鼠黑质多巴胺能神经细胞及炎症因子的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 选取无特定病原体的Wistar大鼠36只(南京大学动物实验中心提供)，雌雄各半，体重196～237 g，平均体重(214.6±8.7)g，饲养温度保持在(20.0±3.0)℃，背景噪音为(40.0±10.0)db，环境湿度控制在58%左右，每天给予12 h光照时间，正常喂养10 d以适应环境。

1.2动物分组与模型制备 将36只大鼠按照随机数字表法分成对照组、模型组、LA组各12只。对照组大鼠给予背部皮下注射1 ml/kg的葵花油，1 次/d，共注射30 d。采用皮下注射鱼藤酮的方法建立PD大鼠模型，模型组、LA组给予2 mg·kg-1·d-1的鱼藤酮，LA组注射鱼藤酮前30 min给予腹腔注射20 mg·kg-1·d-1的LA(重庆药友制药有限责任公司，国药准字H20066706，6 ml:0.15 g )，均为1 次/d，共注射30 d。期间所有大鼠均正常进食。

1.3蛋白质印迹法 所有大鼠在连续注射30 d后断头处死，取中脑后将其置于冰板上，提取包含尾壳核及黑质的脑块，液氮速冻后低温保存。取适量脑组织，研磨后加入裂解液，4℃环境下匀浆5 min，冰浴1 h，4 ℃，13 000 r/min离心15 min，取上清液作为样品。采用考马斯蓝染色法测定蛋白浓度。取适量样品，经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，后转移于聚偏二氟乙烯膜上，加入5%的脱脂奶粉后封闭2 h，加入稀释好的酪氨酸羟化酶(TH)一抗(美国sigma公司)，4℃孵育过夜。用TTBS缓冲液清洗聚偏二氟乙烯膜3次。加入稀释好的二抗(美国sigma公司)，室温避光孵育1 h，漂洗 5 次，目标蛋白光密度值采用远红外荧光扫描成像系统(北京原平皓生物技术有限公司)进行测定，采用β-actin作为内参。

1.4酶联免疫吸附法 采用酶联免疫吸附法检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)，试剂盒购于上海酶联生物科技有限公司。取适量组织标本，研磨后匀浆，取适量加至已包被抗体的酶标板孔内，4℃缓慢摇晃孵育过夜，采用试剂盒自带的洗涤液进行洗涤，加入一抗，室温孵育2 h，洗涤，再加入二抗，洗涤后进行TMB显色，光密度值采用96孔酶标计数仪(上海闪谱生物科技有限公司)检测。

1.5观察指标 观察各组大鼠在建模期间的活动量、食欲、步态、毛色等一般状态。对比各组大鼠的黑质TH/β-actin值、纹状体TH/β-actin值、TNF-α、IL-1β、MDA、GSH水平。

1.6统计学方法 应用SPSS19.0软件，计数资料采用χ2检验，计量资料组间两两比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1三组大鼠的一般状态 对照组大鼠表现正常，活动量大、食欲好、步态稳健、毛色有光泽。模型组大鼠随着用药时间的延长逐渐出现PD的症状，表现为活动量逐渐减少、食欲变差、动作缓慢、步态不稳且多向一侧旋转、毛色暗黄无光泽且脱毛严重、体态呈弓背状。LA组大鼠活动量较少、食欲一般、动作较慢、步态不稳、毛色无光泽。

2.2三组大鼠的黑质TH/β-actin值、纹状体TH/β-actin值比较 三组大鼠的黑质TH/β-actin值、纹状体TH/β-actin值整体比较差异有统计学意义(P<0.05)；对照组的黑质TH/β-actin值、纹状体TH/β-actin值显著高于模型组和LA组(P<0.05)；LA组的黑质TH/β-actin值、纹状体TH/β-actin值显著高于模型组(P<0.05)。见表1。

2.3三组大鼠黑质区域TNF-α和IL-1β光密度值比较 三组大鼠黑质区域的TNF-α和IL-1β光密度值整体比较差异有统计学意义(P<0.05)；对照组黑质区域TNF-α和IL-1β光密度值显著低于模型组和LA组(P<0.05)；LA组黑质区域TNF-α和IL-1β的光密度值显著低于模型组(P<0.05)。见表2。

表1 三组大鼠的黑质TH/β-actin值、纹状体TH/β-actin值比较

与对照组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05，下表同

表2 三组大鼠黑质区域TNF-α和IL-1β的光密度值比较

2.4三组大鼠的纹状体MDA和GSH水平比较 三组大鼠纹状体MDA和GSH水平整体比较差异有统计学意义(P<0.05)；对照组纹状体MDA水平显著低于模型组和LA组(P<0.05)，LA组纹状体MDA水平显著低于模型组(P<0.05)；对照组纹状体GSH水平显著高于模型组和LA组(P<0.05)，LA组纹状体GSH水平显著高于模型组(P<0.05)。见表3。

表3 三组大鼠的纹状体MDA和GSH水平比较

3 讨 论

PD是一种多发于中老年人群的神经系统变性疾病，患者临床表现为震颤、运动缓慢、步态不稳、肌强直等〔4〕。PD患者的主要病理特征是黑质纹状体多巴胺能系统受损，这也是引起运动障碍的主要原因，同时PD患者的中枢神经系统也会受到损伤，并形成路易小体和路易轴突。目前对于引起PD患者运动障碍的脑机制尚无确切的解释，多数学者认为是黑质纹状体多巴胺能通路发生退变，导致其多巴胺含量明显减少，进而引起脑干核团、丘脑、基底神经核、大脑皮层等脑区的功能受损，最终导致PD患者出现运动障碍。炎症反应和PD的发生、发展有着重要的联系，脑内吞噬细胞和其他胶质细胞被激活是神经炎症主要表现，激活后可通过旁分泌途径对神经元造成损伤〔5〕。激活的小胶质细胞可促进IL-1β、IL-6、集落刺激因子(CSF)、干扰素-γ、TNF-α等炎症因子分泌，引起炎症反应。TNF-α可激活天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，进而对细胞凋亡产生影响，并对多巴胺能神经元产生毒性作用；同时TNF-α具有促进小胶质细胞与星形胶质细胞合成CSF的作用，导致血液中的巨噬细胞以及粒细胞聚集到中枢神经的炎症区域，进一步加剧炎症反应〔6〕。IL-1β具有增加神经元内一氧化氮和活性氧生成的作用，一氧化氮可促进转铁蛋白中的自由铁释放，同时一氧化氮和活性氧可增加铁调节蛋白的活性，导致神经元的摄铁功能增强，而铁转出能力降低，最终导致神经细胞内铁聚积，导致神经元细胞死亡；而且细胞内铁聚积能促进小胶质细胞分泌TNF-α和IL-1β，引起恶性循环，对多巴胺能神经细胞造成严重损伤〔7〕。 在本次研究中，对照组大鼠外在表现正常，而模型组和LA组大鼠随着用药时间的加长逐渐出现PD的症状，且模型组的症状更严重，这说明PD大鼠的模型建立成功，同时LA对PD的症状有一定的改善作用。另外研究还显示，PD大鼠的黑质、纹状体的多巴胺含量降低，并伴有炎症反应，这进一步提示PD大鼠建模成功，同时说明LA能有效缓解黑质、纹状体TH水平降低，能够抑制炎症反应，减轻氧化应激反应。究其原因，TH是一种多巴胺合成限速酶，在正常情况下，多巴胺能神经元可将酪氨酸摄取到细胞内，通过和TH催化反应形成左旋多巴，再通过和芳香氨基酸脱羧酶催化反应形成多巴胺，因此黑质和纹状体的TH含量能从侧面反映多巴胺神经元数量〔8〕。MDA是一种脂质代谢产物，GSH是一种自由基清除剂，两指标均能反映氧化应激反应的程度。LA兼具脂溶性与水溶性，能跨过血脑屏障，在大脑中快速扩散。LA具有抗氧化、抗炎、增加谷胱甘肽形成的作用，同时还能通过清除金属元素来抑制自由基生成〔9,10〕。LA能有效抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的过度活化，从而减少炎性因子的释放，对多巴胺能神经元起到保护作用。LA对核因子(NF)-κB信号通路激活有抑制的作用，减少β淀粉样蛋白和过氧化氢(H2O2)对皮层神经元造成的损伤〔11〕。

综上所述，LA能有效改善PD大鼠的疾病症状，同时能缓解黑质、纹状体TH水平降低，对PD大鼠黑质多巴胺能神经细胞起到保护作用；同时能抑制炎症反应，可作为临床治疗PD的新的切入点。

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11徐 利,张春林,周 波,等.硫辛酸对帕金森模型大鼠黑质内神经胶质细胞及多巴胺能神经元的影响〔J〕.神经解剖学杂志,2015;31(1):59-64.

R749

A

1005-9202(2017)24-6047-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.018

鲁 峻(1971-)，男，硕士，主任医师，主要从事神经系统肿瘤及神经功能性疾病方面的研究。

〔2017-07-19修回〕

(编辑 袁左鸣)