缺血性脑卒中患者环氧化酶-1、-2基因多态性与阿司匹林抵抗的关系

胥丽霞 杨改清 官瑞磊 李晓昶 (郑州大学附属郑州中心医院，河南 郑州 450000)

缺血性脑卒中患者环氧化酶-1、-2基因多态性与阿司匹林抵抗的关系

胥丽霞 杨改清 官瑞磊 李晓昶 (郑州大学附属郑州中心医院，河南 郑州 450000)

目的探讨环氧化酶(COX)的基因多态性与阿司匹林抵抗(AR)的关系。方法选取缺血性脑卒中(IS)患者300例，依据血小板聚集率分为阿司匹林敏感组(AS组，180例)、阿司匹林半抵抗组(ASR组，84例)和AR组(36例)；比较3组一般临床资料，采用光比浊法检测血小板聚集率。应用聚合酶链反应(PCR)和限制性片段长度多态性(RFLP)技术检测COX基因多态性，并比较两组基因型和等位基因分布差异。结果AR组与ASR组COX-1上A-842/C50T有统计学差异(P<0.05)，而COX-2-765G>C(rs20417)无统计学差异(P>0.05)。结论COX-1上的T等位基因是其突变基因，C/T和TT突变会增加AR的风险，而COX-2-765G>C的基因突变与AR无相关性。

环氧化酶；基因多态性；阿司匹林抵抗；血小板聚集率

阿司匹林是缺血性脑卒中一级预防和二级预防的治疗基石〔1〕，能明显降低缺血性心脑血管事件的发生率和再发率〔2〕。但临床中仍有一部分患者出现阿司匹林抵抗(AR)〔3〕。目前对AR的定义均缺乏敏感性、特异性和可重复性〔4〕。在脑梗死患者中AR发生率高达44%〔5〕。本文旨在探讨缺血性脑卒中患者AR与环氧化酶(COX)基因多态性的关系。

1 对象与方法

1.1对象 收集2013年1月1日至2015年10月1日在郑州大学附属郑州中心医院住院的缺血性脑卒中患者300例，均符合全国第四届脑血管病学会修订的诊断标准〔6〕，并经颅脑计算机断层扫描(CT)或核磁共振成像(MRI)证实。排除标准：(1)有出血倾向；(2)凝血功能异常；(3)血小板≤100×109/L或≥300×109/L；(4)近4 w有大的外科手术；(5)近1个月内使用非甾体类抗感染药、西洛他唑、双嘧达莫(潘生丁)、华法林、低分子肝素等影响血小板功能的药物；(6)合并肝肾功能障碍或严重感染；(7)同时使用除阿司匹林以外的其他抗血小板聚集药物；(8)阿司匹林禁忌者。本研究经郑州市伦理委员会批准。患者知情同意。所有研究对象服用拜阿司匹林片(德国拜耳制药公司)100 mg每晚1次，7 d后行血小板聚集率检测。收集一般临床资料，包括年龄、性别、既往史(高血压、糖尿病、心脏病及脑梗死)、血常规、血脂、空腹血糖等。

1.2分组与方法 血小板聚集率采用光比浊法测定。服药7 d后采集患者晨起空腹肘静脉血2～3 ml，血液标本置于枸橼酸抗凝血管中(1∶9)，1 000 r/min离心8 min，之后3 000 r/min离心15 min，先后得到富血小板血浆和乏血小板血浆。检测血小板聚集率的诱导剂有二磷酸腺苷(ADP)和花生四烯酸(AA)。依据血小板聚集率分为AR组36例、阿司匹林半抵抗(ASR)组84例和阿司匹林敏感(AS)组180例。10 μmol/L ADP诱导的血小板聚集率≥70%且500 μmol/L AA诱发的血小板聚集率≥20%为AR，符合二者之一者为ASR，10 μmol/L ADP诱导的血小板聚集率<70%且500 μmol/L花生四烯酸AA诱发的血小板聚集率<20%为AS。3组一般临床资料无明显差异(P>0.05),具有可比性。见表1。

表1 3组一般临床资料比较

1.3基因提取与测序

1.3.1DNA提取 DNA提取采用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)方法，采集患者晨起空腹肘静脉血2 ml，采血试管内含有枸橼酸钠，应用DNA提取试剂盒(QIAGNE公司)，提取全血标本DNA，-80℃保存备用。

1.3.2聚合酶链反应(PCR)和限制性片段长度多态性(RFLP)技术检测 COX-1上A-842G/C50T引物：上游5′-GGTGCCCGGTGGGGAATTTT-3′，下游5-GAGGGGAAAGGAGGGGGTTG-3′，扩增长度245 bp，包含SmuI酶切片段。COX-2上-765G>C引物：上游5′-ATTCTGGCCATCGCCGCTTC-3′，下游5′-CTCCTTGTTTCTTGGAAAGAGACG-3′，扩增长度157 bp，包含 Bsh 1236I 酶切片段。并采用 RFLP技术检测其基因多态性。COX-1扩增产物采用SmuI酶切；COX-2扩增产物采用Bsh 1236I酶切。

1.4统计学方法 应用SPSS18.0软件进行t、χ2检验、Logistic回归分析。

2 结 果

COX-1 A-842/C50T有C/C、C/T、和T/T 3种基因型。CC基因型(野生型)的扩增产物可被完全切断，电泳可见120 bp和125 bp的两条片段(因为距离非常近，因此常可见一个条带)；CT基因型为杂合子，可见245 bp、120 bp和125 bp 3条片段；TT基因型(突变纯合子)不能被酶切断，仅见 245 bp一条片段。见图1。

COX-2-765G/C有G/G、G/C和C/C 3种基因型。G/G基因型(野生型)的扩增产物可被完全切断，电泳可见134 bp片段(23 bp片段在琼脂糖凝胶中不显影)；G/C基因型为杂合子，可见157 bp和134 bp 2条片段；C/C基因型(突变纯合子)不能被酶切断，仅见157 bp 1条片段。见图2。

ASR和AR组T等位基因频率均高于AS组；COX-1 C50T基因型在AS与ASR组、AS组与AR组差异有统计学意义(χ2=6.897,7.052;P=0.012，0.007)。COX-2上-765G>C的G和C等位基因在3组之间分布平衡，基因型G/G、G/C、C/C在3组之间也无统计学差异(P>0.05)。见表2。

图1 COX-1 A-842/C50T

图2 COX-2-765G/C

组别n等位基因频率(COX⁃1C50T)CT基因型频率(COX⁃1C50T)C/CC/TT/T等位基因频率(COX⁃2⁃765G>C)GC基因型频率(COX⁃2⁃765G>C)G/GG/CC/CAS组180120(667)60(333)95(528)72(400)13(72)162(900)18(100)162(900)12(167)6(33)ASR组8452(619)32(381)42(500)1)34(405)1)8(95)1)73(869)11(131)71(845)8(95)5(60)AR组3621(583)1)15(417)1)18(500)1)15(417)1)3(83)1)29(806)7(194)29(806)4(111)3(83)

与AS组比较：1)P<0.05

3 讨 论

心脑血管患者服用阿司匹林，可以降低25%的再发心脑血管事件的风险〔2〕。有荟萃分析指出，阿司匹林不敏感者心脑血管事件的发生率是AS者的3.8倍〔7〕。然而，AR的主要原因在于依从性差〔8〕。英国的一项研究指出，在排除可依从性因素后，AR的发生率可降至25%〔4〕。美国弗明汉心脏病研究发现，基因变异是血小板聚集的决定性因素〔9〕。在动脉硬化性梗死灶中，存在COX过度表达现象〔10〕。但是，关于AR和COX基因多态性研究的结论却不尽相同。这可能和研究对象的种族不一致或试验研究方法差异有关。目前临床和实验室中，检测血小板聚集率的方法多种多样〔11〕。目前没有一个统一的方法和标准，也是造成AR发生率在各个研究中差异较大的原因。本研究采用AA和ADP两种诱导剂来检测血小板聚集率，可以减少其误差、提高可精确率。

COX包括COX-1和COX-2，在血小板聚集方面，以COX-1的功能为主〔12〕。在实验室和临床试验中发现，低剂量的阿司匹林即可不可逆地抑制COX-1的活性，而COX-2却难以被抑制〔13〕。Agúndez等〔14〕对多种种族的人群研究发现，在欧洲人群中，与阿司匹林有关的COX-1基因位点是rs3842787和rs5789，而俄罗斯人是rs3842789和rs384292，提示各种族基因的差异可能是研究结果差异的原因之一。C50T基因片段位于第17位点，是调节阿司匹林治疗反应程度的决定性因素，COX-1上C50T基因片段的变异性在亚洲人群的发生率较低〔15〕。本试验结果提示T等位基因可能是AR的重要原因之一。

关于COX-2上-765G>C基因型分布，本试验提示G到C的变异不会增加AR的发生，这与相关研究结论均一致〔16〕。然而，也有研究〔17〕提示，-765G>C(rs20417)与AR显著相关。本研究提示COX-1上C50T基因突变会增加AR风险，为临床选择抗血小板聚集药物提供一定的参考依据。

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8Kenneth A，Schwartz MD.Aspirin resistance：a clinical review focused on the most common cause，noncompliance〔J〕.Neurohospitalist，2011；1(2):94-103.

9O′Donnell CJ，Larson MG，Feng D，etal.Genetic and environmental contributions to platelet aggregation：the framingham heart study〔J〕.Circulation，2001；103(25)：3051-6.

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R743.32

A

1005-9202(2017)24-6081-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.032

郑州市卫生局课题(No.122102310110)

杨改清(1966-)，女，医学博士，主任医师，主要从事脑血管、癫痫及睡眠障碍疾病研究。

胥丽霞(1984-)，女，硕士，主治医师，主要从事脑血管病和神经系统变性疾病研究。

〔2017-04-11修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)