肿瘤干细胞标记物CD133和CD44在卵巢癌组织的表达及其临床意义

童文先 何安兵 张 涛 镇鸿燕 刘爱华 彭秀兰 王 虎 田 倩 李晓光

(武汉市第五医院肿瘤1科，湖北 武汉 430050)

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肿瘤干细胞标记物CD133和CD44在卵巢癌组织的表达及其临床意义

童文先 何安兵 张 涛1镇鸿燕2刘爱华 彭秀兰 王 虎 田 倩 李晓光

(武汉市第五医院肿瘤1科，湖北 武汉 430050)

目的研究卵巢癌组织中CD133、CD44的表达及其与卵巢癌患者预后的关系。方法免疫组化法检测CD133、CD44在卵巢癌组织中的表达水平，分析其表达水平与卵巢癌临床病理指标的相关性。结果CD133在卵巢癌组中阳性表达率分别为47.22%(17/36)，CD44阳性表达率分别为52.78%(19/36)，差异有统计学意义(P<0.05)。CD133和CD44的表达均与临床病理分期和淋巴结转移有显著相关性(P<0.05)。Spearman相关性分析显示CD133表达与CD44的表达有相关性(r=0.536，P=0.000)。结论CD133和CD44的高表达可能与卵巢癌的发生、发展有一定关系。

卵巢癌；肿瘤干细胞；CD133；CD44

卵巢癌是女性生殖系统3大恶性肿瘤之一，死亡率却高居妇科肿瘤首位，城市女性中卵巢癌发病率排在妇科肿瘤第一位〔1〕。美国癌症协会最新预测美国2015年、2016年的卵巢癌的发病人数为21 290、22 280，死亡人数为14 180、14 240〔2，3〕；病死率高达66.6%、64.49%。由于卵巢癌病因不易发现，早期症状不够典型，约70%患者初次诊断就已经为晚期，且其中约70%患者两年内就会出现复发和转移〔4〕。恶性肿瘤中存在少部分具有干细胞性质的细胞群，具有自我更新能力，会导致肿瘤的无限生长；且具有多向分化潜能，导致肿瘤细胞的异质性；常处于静止休眠状态，对放化疗具有耐受能力。这些肿瘤干细胞是肿瘤发生、发展的根源，也是临床上导致肿瘤复发、转移的根本原因。因此，肿瘤干细胞的研究具有理论和实践的双重指导意义。五次跨膜糖蛋白CD133(又称Prominin-1)，是多种肿瘤干细胞的重要表面标记〔5〕。CD44是一种分布极广泛黏附分子，是细胞表面跨膜糖蛋白，主要功能为参与细胞、细胞以及细胞、基质之间的特异性粘连过程〔6〕。目前，已有研究将CD133、CD44应用在骨肉瘤〔7〕、胃癌〔8〕、肝癌〔9〕、结直肠癌〔10〕、舌鳞状细胞癌〔11〕、胃腺癌〔12〕中，但是在卵巢癌中的联合研究较少。本研究以卵巢癌为研究对象，通过免疫组织化学方法观察干细胞标记物CD133和CD44的表达情况，并探讨二者临床表达的相关性，为以肿瘤干细胞为靶向的卵巢癌治疗方案提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1材料 收集2013年1月至2016年8月在武汉市第五医院肿瘤科收治的具有完整病理资料的原发性卵巢癌手术切除标本36例(患者在手术前均未进行放、化疗及其他抗肿瘤治疗)。入选病例随访至患者死亡或截止至2016年8月31日，随访时间为3～29个月。患者年龄37～85岁，平均52.8岁；根据国际妇产科学联盟(FIGO)关于卵巢癌的手术、病理分期的标准进行分类，早期(FIGO Ⅰ+Ⅱ期)卵巢癌11例，晚期(FIGO Ⅲ+Ⅳ期)卵巢癌25例；浆液性癌26例，黏液性癌5例，宫内膜样癌2例，透明细胞癌3例。患者伴有腹腔脏器及淋巴结转移者16例，有腹水者21例。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1试剂 一抗兔抗人CD133抗体、小鼠抗人CD44抗体、二抗为酶标羊抗鼠/兔IgG合物，均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2.2免疫组化 石蜡包埋组织切片，用二甲苯、酒精进行脱蜡，蒸馏水漂洗5 min。3%过氧化氢常温灭活10 min，水洗。通过EDTA稀释10倍，微波炉大火煮约7～8 min，室温冷却5 min，再大火煮约7～8 min进行微波热修复。冷却0.5 h至室温后，滴加5%BSA，37℃温箱孵育0.5 h(不洗)做封闭处理。滴加一抗，37℃温箱孵育2.0 h，PBS洗5 min×3次。抗体稀释浓度比为1∶100。滴加生物素化羊抗兔IgG(二抗)，37℃温箱孵育0.5 h，PBS洗5 min×3次。滴加SABC，37℃温箱孵育0.5 h，PBS洗5 min×3次。再进行DAB显色，复染，返蓝，封片，用显微镜观察结果。

1.3结果判定 CD133、CD44均主要着色于胞质和/或胞膜，按染色强度的差异，DAB阳性经过染色成为棕色或黄色。在4个不同高倍视野下观察200个癌细胞，计算阳性细胞数量，如阳性细胞数>10%，则为阳性。若≤10%，则为阴性。该判定由3位病理科医生独立进行观察判断，若判断不一致，则可对切片共同进行观察。

1.4统计学分析 应用SPSS20.0软件。计量资料分析采用t检验，计数资料分析应用χ2检验；以Cox比例风险回归模型作多因素分析。

2 结 果

2.1随访结果 本组病例均采用电话或定期门诊随访，36例患者均得到随访，中位随访时间18个月(2～30个月)，12例死亡，8例无瘤生存，16例带瘤生存。

2.2卵巢癌组织中CD133和CD44的表达 36例卵巢癌组织中，共16例(44.44%)有转移。CD133阳性表达率47.22%(17/36)(图1)；CD44阳性表达率52.78%(19/36)(图2)。

2.3CD133和CD44表达与卵巢癌临床特征的关系 四种卵巢癌中常见的组织学分型间CD44阳性率无显著差别(P>0.05)，四种组织学分型间CD133阳性率无显著差别(P>0.05)，见表1。CD133阳性组淋巴结转移率与阴性组差异有统计学意义(P<0.05)。CD44阳性组淋巴结转移率与阴性组差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4原发性卵巢癌中肿瘤表面标记物CD133与CD44表达的相互关系 本研究显示原发性卵巢癌中肿瘤表面标记物CD133与CD44的表达之间呈正相关性(r=0.536，P<0.05)，表2。

2.5Cox回归分析 将卵巢癌患者年龄(分为≥50岁组与<50岁组)、FIGO分期(Ⅰ+Ⅱ期组与Ⅲ+Ⅳ期组)、淋巴结转移(转移组与无转移组)、腹水(有腹水组与无腹水组)、CD133表达(阳性组与阴性组)、CD44表达(阳性组与阴性组)等相关因素引入Cox模型进行分析，CD133、CD44及FIGO分期是影响卵巢癌患者预后的独立因素。见表3。

图1 CD133阳性表达情况(DAB，×200)

图2 CD44阳性表达情况(DBA，×200)

变量nCD133阳性P值CD44阳性P值年龄(岁)>005>005≤50167(4375)8(5000)>502010(5000)11(5500)组织类型(n)>005>005浆液型2611(4230)13(5000)黏液型53(6000)2(4000)内膜样21(5000)2(100．00)透明型32(6667)2(6667)临床分期(n)<005<005Ⅰ～Ⅱ115(4545)7(6364)Ⅲ～Ⅳ2512(4800)12(4800)淋巴结转移(n)<005<005有168(5000)12(7500)无209(4500)7(3500)腹水(n)<005<005有2112(5714)13(6190)无155(3333)6(4000)

表2 CD133与CD44表达的关系(n)

表3 36例卵巢癌患者多因素分析

3 讨 论

所谓肿瘤干细胞，指的是肿瘤中少数具有“干细胞性质”的细胞。这些细胞常处于细胞周期的G0～G1期，放、化疗对其很难起作用，它们可不断自我更新，并持续分化出具有不同增殖活性的肿瘤细胞〔5〕。根据其这一特质，常规治疗很难根除肿瘤干细胞，这是导致肿瘤复发、转移和影响治疗效果的重要原因。现在，已有较多研究将CD133和CD44用作肿瘤干细胞分离、鉴定等过程中的标志物。CD133又可称为Prominin-1，是Prominin家族的一位成员，具有五个跨膜结构域和两个糖基化膜外环的结构〔13，14〕。近年来，多项研究证明CD133是多种恶性肿瘤干细胞普遍的表面标记物，虽然我们对其功能并不完全了解，但是已有研究显示，CD133的某些功能可能对肿瘤干细胞性质的维持和分化发挥了相当重要的作用。CD44是细胞表面跨膜糖蛋白，是一种分布极广泛黏附分子，其主要功能为参与细胞、细胞以及细胞、基质之间的特异性粘连过程。目前，CD44蛋白作为多种已知肿瘤干细胞的标记物已经有了相当的研究成果，越来越受到与生命科学科研工作者的重视。

此前，已有研究将CD133和CD44联合用于研究骨肉瘤〔7〕、胃癌〔8〕、舌鳞状细胞癌〔11〕、肺癌〔15〕组织的表达情况，证实CD133、CD44可以作为胃癌、舌癌和肺癌患者早期诊断的肿瘤标志物。本研究发现CD133和CD44这两种蛋白在卵巢癌组织中的表达在某种程度上可以体现肿瘤干细胞的表达和分布。根据这两种标记物的表达情况，能对患者的预后进行较为可靠的预测，指导临床实践。本研究还发现，CD44阳性的肿瘤干细胞在特殊的微环境作用下，能够不断的生长并向外迁移；并且分化越差的肿瘤，这种团簇状的肿瘤干细胞群越多，肿瘤生长更快，预后更差。CD133蛋白的表达与卵巢癌患者的临床分期及转移关系有着紧密的联系，若CD133蛋白表达阳性率较高，患者临床分期相对较晚，就较容易出现淋巴结转移。

本研究由于病例数较少，缺乏随机对照，且对CD133和CD44阳性细胞的特点及转移机制的研究不足，对卵巢癌患者临床预后的指导意义说明力度相对较弱，需要研究者进一步扩大样本量进行研究，提高临床的指导性。另外，需要找到在如血液等反映患者肿瘤干细胞状态的相关标记物，即时知晓肿瘤发展状态，为临床治疗和预后提供及时的信息，为卵巢癌患者诊断、治疗和预后提供保障。这些需要在后续研究中进一步探讨。

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2Siegel R,Ma J,Zou Z,etal.Cancer statistics,2015〔J〕.CA Cancer J Clin,2015;65(1):5-29.

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R73

A

1005-9202(2017)24-6098-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.040

湖北省卫生计生科研基金资助(WJ2015MB245)

1 华中科技大学同济医学院附属协和医院肿瘤中心

2 江汉大学医学院

何安兵(1963-)，男，主任医师，主要从事肿瘤放疗学研究。

童文先(1981-)，女，主治医师，主要从事肿瘤放疗学研究。

〔2017-09-26修回〕

(编辑 袁左鸣)