环状RNA与自身免疫性疾病

罗 璇，彭 钰，邓垂文，杜志荣，费允云

环状RNA(circular RNAs，circRNAs)是一类具有闭合环状结构的、稳定的竞争性内源性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)。circRNAs的研究始于1976年Sanger等[1]在植物类病毒中发现闭合环状的RNA结构，1986年Kos等[2]在肝炎病毒中也发现了同样结构的RNA，1991年Nigro等[3]提出了人类细胞中可能也存在着circRNAs，但是人们一直认为circRNAs的产生是由于基因的错误剪切。随着RNA-Seq技术和生物信息学的发展对大规模转录数据进行分析，发现circRNAs大量存在于各类细胞中，且circRNAs的形成有一套完整的调控机制，是一类缺少5’端帽和3’poly(A)尾、以共价键连接首尾而形成的有稳定环状结构的RNA，其结构高度保守且具有表达特异性，具有吸附微小RNA(microRNA,miRNA)、调控基因表达、翻译蛋白质等的能力[4-5]，参与生物多种细胞的生物学过程。目前的研究认为，circRNAs可参与多种疾病的发生和发展，并有可能成为疾病诊断或预后判断的标志物。本文对circRNAs的形成机制、生物学功能及其与疾病，特别是自身免疫性疾病(autoimmune disease，AD)的关系进行综述，为AD的病因、诊断及治疗提供新的研究方向。

1 circRNAs的形成机制

已有研究报道，真核细胞中circRNAs来源于前体mRNA的反向剪接[4]，但其产生的机制尚未完全阐明。Jeck等[6]提出了circRNAs生成模型，即套索驱动的环化和内含子配对驱动的环化，前者是由一个外显子的3’剪接供体与另外一个外显子的5’剪接受体共价结合，通过外显子的跳跃形成套索，剪接体将内含子移除后即形成circRNAs；后者2个内含子通过碱基配对形成环形结构，内含子移除或保留，形成相应的circRNAs。此外，还有RNA结合蛋白(RNA binding protein，RBP)相关途径，部分circRNAs是在RBP的调控下形成的，如QKI(Quaking)和Muscleblind(MBL)，RBP与内含子序列结合后将两侧的内含子侧翼序列相连接，从而形成环状结构，RBP水平与circRNAs的生物合成水平相关[7-8]。

2 circRNAs的特点及生物学功能

2.1 circRNAs的特点

转录组数据分析显示，circRNAs广泛存在于多种组织中，不同组织中circRNAs的表达有明显差异[9]。circRNAs为闭合环状结构，缺少5’端帽和3’端poly A尾，不易被核酸外切酶降解，故circRNAs具有高度稳定性，这也是circRNAs可维持在较高丰度的原因之一[6]，部分circRNAs的丰度甚至超过线性RNA[4]。在哺乳动物中，大部分circRNAs在进化过程中有较强的保守性，5%～30%的环状RNA完全保守[6]。

2.2 circRNAs的生物学功能

随着circRNAs研究的深入，其生物学功能也慢慢被揭示，主要有以下主要功能。

2.2.1 miRNA“海绵”: 在细胞内，部分circRNAs与长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)的功能相似，可通过与miRNAs的相互作用而发挥miRNA“海绵”功能，抑制miRNAs的功能，属于竞争性内源性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)。较经典的研究是ciRS-7与miR-7的结合，ciRS-7又称CDR1as，已发现CDR1as上有超过70个miR-7结合位点，ciRS-7与miR-7结合后能促进miRNA与Argonaute(AGO)特异性结合，抑制miR-7的功能[10]。环形同源结构域相关蛋白激酶3(circular homeodomain-interacting protein kinase 3，circHIPK3)可与miR-124结合并抑制其作为肿瘤抑制因子的功能，调控细胞生长[11]。目前通过生物信息学技术找到的circRNA-miRNA的结合位点数量较少，也就是说大部分的circRNAs并不能作为miRNA“海绵”。

2.2.2 circRNAs与蛋白质结合: 已有研究表明，circRNAs可与蛋白质结合而影响蛋白质功能。circFoxo3是由叉头样转录因子3(Forkhead box O3，Foxo3)基因编码的circRNA，在非癌细胞中呈高表达，circFoxo3可与细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent- kinase 2，CDK2)和p21结合，从而抑制细胞周期的进程[12]。circAmotl1可与3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1，PDK1)和AKT丝/苏氨酸激酶1(AKT serine/threonine kinase 1，AKT1)结合，使AKT1磷酸化，对心血管疾患发挥预防作用[13]。

2.2.3 circRNAs对基因表达的调控功能: 大部分circRNAs位于细胞质，但研究发现，部分circRNAs参与转录和转录后基因表达，尤其是包含有内含子的外显子-内含子circRNAs(EIciRNAs)可在细胞核中参与基因转录的调控。Li等[14]报道显示，EIciRNAs可通过RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ，Pol Ⅱ)参与转录过程，特异性敲除环形真核翻译起始因子3亚基J(circular eukaryotic transla-tion initiation factor 3 subunit J，circEIF3J)和环形多聚腺苷酸结合蛋白相互作用蛋白2(circular polyadenylate- binding protein-interacting protein 2，circPAIP2)后，EIF3J和PAIP2基因转录水平下降，认为circEIF3J和circPAIP2通过U1小核核糖核蛋白(small nuclear ribonucleic proteins，snRNP)构成EIciRNA-U1 snRNP-Pol Ⅱ复合物，并作为基因启动子促进基因表达。

2.2.4 circRNAs作为翻译模板: circRNAs属于非编码RNA，随着研究的深入，越来越多的证据表明circRNAs可作为翻译模板。通过计算机预测和质谱数据库分析对比发现，细胞内13%的circRNAs存在N6-腺苷酸甲基化(N6-methyladenosine，m6A)修饰，这些circRNAs可通过募集含YTH结构域家族蛋白3(YTH domain-containing family protein 3，YTHDF3)来招募真核翻译起始因子4 Fγ2(eukaryotic translation initiation factor 4F gamma 2，eIF4G2)蛋白和其他翻译起始因子，启动蛋白质翻译[15]。Legnini等[16]发现hsa_circ_ZNF609是ZNF609基因第二外显子独自环化形成，在内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)驱动下以剪切依赖模式进行蛋白质翻译。Pamudurti等[17]发现果蝇体内有大量内源性circRNAs，其中大多数来源于蛋白编码基因，并且含有完整的外显子序列，通过核糖体印记数据进行CircRNAs挖掘，推测核糖体相关circRNAs具有蛋白编码能力，且一系列实验证明果蝇内源性circRNAs具有编码蛋白的能力。Zhang等[18]研究证明，来自SNF2 histone linker PHD RING helicase(SHPRH)基因的circ-SHPRH能够编码多肽，且该多肽是在跨过接口位点后终止翻译的产物。

3 circRNAs与疾病的关系

3.1 circRNAs与癌症

目前研究认为，由于circRNAs表达丰富且具有组织特异性，在低增生的组织或器官中也有较高的丰度，如脑组织、血液等，具有稳定性高且高度保守的特点，可作为癌症诊断和预后的潜在生物标志物。在胃癌中hsa_circ_0000096、circPVT1、hsa_circ_002059等circRNAs表达有差异[19-21]，肝癌中hsa_circ_0001649等circRNAs差异表达明显[22]。随着ncRNA网络研究的深入，认为circRNAs可通过miRNAs或蛋白质而参与肿瘤免疫过程。circAmotl1可使miR-17启动子甲基化而抑制miR- 17的表达，促进在肿瘤免疫中发挥重要作用的信号转导及转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)的表达[23]，在结肠癌中hsa_circ_0020397通过与miR-138的结合而抑制miR-138活性，从而增加端粒酶逆转录酶和PD-L1的表达[24]。

3.2 circRNAs与其他疾病

在哺乳动物脑组织中circRNAs含量高于其他组织，研究发现，ciR-7作为miR-7“海绵”而调控miR-7靶基因的表达，如表皮生长因子受体基因、SNCA基因、胰岛素受体底物2基因、α-突触核蛋白基因[10]和泛素结合酶E2A基因[25]，参与帕金森病和阿尔茨海默病的发生。随着芯片技术和二代测序技术的进步，研究人员发现其他神经系统疾病的发生和发展也与circRNAs相关，如多系统萎缩症、脑缺血再灌注损伤。研究发现糖尿病引起的视网膜血管功能障碍中circHIPK3(has_circ_0000284)水平显著升高，深入研究后发现circHIPK3可竞争性地结合miR-30a，调控血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C ，VEGFC)、卷曲受体4(frizzled class receptor 4，FZD4)和Wnt 家族成员2(Wnt family member 2，WNT2)基因，在糖尿病引起的视网膜血管功能障碍中发挥作用[26]。

4 circRNAs与AD

研究发现，has_circ_100783在CD8+T细胞中过表达，且可通过调控磷蛋白相关通路与衰老相关的CD8+T细胞的CD28受体的缺失有关[27]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的小鼠腹腔巨噬细胞炎症反应中观察到mmu_circ_000790显著上调，干扰其表达，抑制巨噬细胞分泌白细胞介素(interleukin 6，IL-6)。据此，作者推测mmu_circ_000790通过竞争性地结合调控IL-6基因表达的miRNA而影响该miRNA对IL-6的负性调控[28]。

AD是一组病因未明的慢性炎症性疾病，其特点是自身反应T、B淋巴细胞过度活化，产生大量自身抗体，造成多系统、多器官的广泛损害。目前，AD的病因和发病机制尚未完全阐明。既往研究表明，AD可能与遗传、环境、感染等因素有关，在特定的遗传背景和环境因素下，机体的自身免疫系统异常激活，造成免疫耐受缺失，引起免疫细胞功能异常，这是导致AD组织损伤的主要原因。关于AD相关miRNAs的研究发现，AD的典型表观遗传机制是miRNAs对基因的调控。部分miRNAs与自身免疫过程相关，包括T、B淋巴细胞的激活、炎症因子和趋化因子的产生及自噬现象等[29-31]。在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)[32-33]、干燥综合征(Sjögren syndrome，SS)[34]、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)[35-36]、原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis，PBC)[37]等AD中已发现数种miRNAs的表达变化，这些变化参与疾病的发生和发展。circRNAs在功能上可作为miRNA“海绵”，即circRNAs的表达变化可能影响miRNAs的螯合能力，进而导致miRNAs基因靶点的改变，达到调控基因表达的目的。circRNAs在AD的发生和发展中是否发挥作用值得探究。目前，关于circRNAs在AD中作用的研究正在进行中[38]。Li等[39]对6例SLE患者及6位健康对照者的血浆样本行circRNAs芯片检测，并对差异表达的circRNAs进行分析，发现SLE患者血浆中显著下调的hsa_circ_100226可与miR-138-5p、miR-145-3p、miR-24-3p、miR-620及miR-875-3p结合，其中miR-138-5p可促进肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)诱导的细胞凋亡，即hsa_circ_100226可通过miR-138-5影响细胞凋亡。此外作者认为SLE患者显著下调的circRNAs有可能成为SLE潜在生物学标志物，包括hsa_circ_102584、hsa_circ_400011、hsa_circ_101471和 hsa_circ_100226。研究还发现与健康人相比，SLE患者外周血T细胞存在127个差异表达的circRNAs，在Jurkat细胞中特异性敲低 hsa_circ_0045272可使Jurkat 细胞早期凋亡增加，同时Jurkat 细胞分泌的IL-2增加，推测SLE患者中hsa_circ_0045272发挥负性调控细胞凋亡及IL-2分泌的作用[40]。宋新强等[41]采用circRNAs芯片技术分析RA患者全血细胞差异表达的circRNAs并与健康者进行比较，然后对这些circRNAs涉及的基因做基因本体(gene ontology，GO)分析，结果表明相关差异表达基因的功能主要涉及生物学调控、细胞分化、代谢等过程，但与前人发现的RA致病基因(HLA-DRB1、HLA-A、HLA-DPB1、PADI4、PT-PN22、CTLA4、FCRL3、IL2/IL21、STAT4、TNFAIP3、TRAF1/C5等)没有重叠，因此作者认为circRNAs可能参与RA发病的调节，而不是直接致病。Ouyang等[42]将RA患者的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中差异表达的circRNAs与健康人进行比较，发现 circRNAs与RA患者病情活动度及炎症指标(DAS28、CRP、ESR、HAQ)间的相关性无统计学意义，但hsa_circ_104871、hsa_circ_003524、hsa_circ_101873和hsa_circ_103047对RA有潜在的诊断价值，其中hsa_circ_104871对RA的诊断价值最高，但仍需要深入研究加以验证。Zheng 等[43]采用芯片分析法对RA患者PBMC的circRNAs与健康人进行比较，发现数个差异表达的circRNAs所在基因可能都与RA的发生和发展相关。Zheng等[44]对原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)患者血浆中差异表达的circRNAs与健康对照者进行比较，发现未接受熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)治疗的患者血浆中hsa_circ_402458表达明显上调，根据受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)分析结果，hsa_circ_402458为PBC的最佳标志物。

5 总结与展望

circRNAs是近年来备受关注的ceRNA，在许多领域都展现出其独特作用，研究认为circRNAs稳定性及保守性高，在机体的组织和体液中有较高丰度，且参与疾病的发生及发展，可作为疾病诊断的潜在生物标志物，尤其是circRNAs与肿瘤的发生、进展、转移等病理过程相关。虽然目前对于circRNAs的形成机制及其功能的研究还十分有限，仅揭示了少数circRNAs的功能和机制，但已确定circRNAs在疾病的发生和发展中发挥重要作用。目前，与AD相关的circRNAs研究主要聚焦于其异常表达及作为疾病诊断标志物领域，这仅是circRNAs研究的冰山一角，circRNAs在AD的发病及进展中究竟如何发挥调控作用仍亟待研究。随着分子生物学技术的发展、对circRNAs与多种疾病关系的认识及circRNAs作用机制研究的不断深入，circRNAs在AD的诊断、预后和治疗中具有良好的应用前景。