环状RNA的生物学功能及其在气道变应性疾病中的作用

田 琴，李 静，李 勇

气道变应性疾病是特应性个体接触变应原后主要由IgE介导的Ⅰ型变态反应性疾病,其病理过程涉及肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的活化、脱颗粒及释放炎性介质,并有中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞、T细胞及B细胞的共同参与，从而引起血管通透性增加，气道平滑肌收缩，黏液分泌增多及气道高反应性和重塑。此类疾病以变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)和支气管哮喘居多，目前其发病机制尚未完全阐明[1-2]。目前AR和哮喘的发病率呈显著增加的趋势，不仅影响患者的学习、工作、睡眠及生活质量，而且给个人和社会带来了很大的经济负担[3]。因此，进一步探寻气道变应性疾病的发病机制对疾病的防治具有重要的临床意义。

环状RNA(circular RNA，circRNA)是新确认的一类非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)分子。近年来随着RNA测序技术和生物信息学等技术的发展，发现circRNA大量存在于真核细胞中，可参与基因的转录后调控，并且可通过微小RNA(microRNA，miRNA)海绵作用来调控基因的表达，从而在疾病的发生和发展中发挥重要作用[4]。考虑到miRNA在气道变应性疾病中的意义以及circRNA作为miRNA海绵的作用，认为circRNA可能成为该疾病的治疗靶点。本文对circRNA来源、生物学特性、其在气道变应性疾病中的作用及其调控机制进行综述，以探讨circRNA与气道变应性疾病发病的关系。

1 CircRNA概述

1.1 CircRNA的来源

CircRNA是一个闭合环状RNA分子，于20世纪70年代发现于RNA病毒中[5-7]。1979年Hsu等[8]在电子显微镜下首次证明circRNA存在于真核细胞的细胞质中。1993年由外显子来源的circRNA在人体细胞的转录产物中被发现，但当时认为circRNA仅是一类因外显子转录过程中发生错误剪接的副产品，因而对它们的研究不够深入[9]。近年来，高通量RNA测序研究发现数千个circRNAs存在于人类、鼠的转录组和哺乳动物大脑中[10-11]。CircRNA由特殊的前体mRNA可变剪接而产生，其剪接形式具有多样性，其形成方式包括外显子环化和内含子环化(intron circularization)两类。根据circRNA中包含的序列可将circRNA分为3类，即仅由外显子组成的外显子circRNA(exon circRNA，ecircRNA)[12]、内含子套索来源的circRNA(circular intronic RNA，ciRNA)[13]，及包含外显子和内含子序列的EIciRNA[14]。大部分circRNAs来自外显子，而少量circRNAs则是由内含子直接环化所形成，其中一些ecircRNAs来自于与剪接因子、DNA甲基转移酶相关的基因，其外显子环化依赖于两端内含子中的反向互补序列[15]。Zhang等[13]提出的ciRNA模型揭示circRNA也可来源于内含子，敲除circRNA基因可降低其亲本基因的表达。在EIciRNA中，外显子被环化，内含子在外显子之间被保留，EIciRNA主要定位于细胞核中，与U1 snRNP相互作用，促进其亲本基因的转录[15]。

1.2 CircRNA的生物学特性

目前研究发现circRNA具有下列特性：即circRNA很丰富，广泛存在于人类真核细胞中，在某些情况下环状分子的数量超过与它们相关的线性mRNA的10倍以上[9-10，12]。RNA环化是在平行或同源基因中保存的，表明circRNA具有高度保守性[10，12]。CircRNA分子呈封闭环状结构，不易被核糖核酸酶R(RNase R)所降解，结构比线性RNA更稳定[12，16-17]；circRNA分子富含miRNA反应元件(miRNA response element，MRE)，通过与miRNA相互作用来竞争性内源性RNA(ceRNA)，阻断miRNA对其靶基因的抑制作用，从而在细胞中发挥miRNA海绵的作用[18]。

2 CircRNA的功能

研究表明，circRNA作为一种新型的miRNA活性调控分子,可在基因表达调控中发挥miRNA海绵、调控亲本基因转录和参与蛋白质合成等重要作用[18-19]。

2.1 CircRNA作为miRNA海绵的作用

在circRNA功能的研究中，小脑退化相关蛋白1反义转录物(antisense to the cerebellar degenera-tion-related protein1 transcript，CDR1as or ciRS-7)作为miR-7海绵的作用的研究备受关注。人类CDR1as含有74个miR-7应答元件，并与阿格蛋白(argonaute，AGO)、miRNA效应蛋白紧密结合。CDR1as主要位于细胞质中，并在脑组织中与miR-7高度共表达[18-19]。Hansen等[18]研究报道，HEK293细胞中CDR1as可充当miR-7海绵，有效地降低miR-7所产生的基因沉默的潜能。将CDR1as注入斑马鱼胚胎可以重现miR-7沉默引起的中脑容量的减少，再次注入miR-7前体后其中脑容量可以部分地恢复[19]。另一项关于睾丸特异性基因SRY的circRNA研究显示，其包含16个miR-138的MRE，能显著降低miR-138的基因沉默效力[18]。研究还发现在circRNA中miRNA结合点的基因多态性下降，这也说明circRNA可作为miRNA海绵而发挥调控作用[20]。

2.2 CircRNA对亲本基因转录的促进作用

Zhang等[13]研究发现，敲除ciRNA能降低其亲本基因的表达，如敲除ci-ankrd52能显著降低ankrd52 mRNA的表达，随着ci-ankrd52积累到其转录位点与磷酸化Pol II部分共区域化而对Pol II转录起正性调控作用。这些发现表明，敲除ci-ankrd52能降低前体-ankrd5的转录效率，从而下调ankrd52 mRNA的表达。因此，ciRNA对Pol II转录进行正性调控，促进了其亲本基因的高效转录。

另有研究发现，具有代表性的EIciRNA(circEIF3J和circPAIP2)的敲除分别降低了其亲本基因EIF3J和PAIP2 mRNA的表达水平。敲除EIciRNA可以减少Pol Ⅱ、U1A和U1C蛋白与其亲本基因启动子的结合，阻断U1 snRNA，减少 EIciRNA与Pol Ⅱ之间的联系，阻止 EIciRNA与其亲本基因启动子之间的相互作用，消除EIciRNA敲除对其亲本基因mRNA表达水平的影响，与此同时可阻断结合位点在EIciRNA的U1 snRNA，减少EIciRNA与Pol Ⅱ和U1 snRNA的相互作用，同时也减少了亲本基因的启动子与U1 snRNP和EIciRNA的相互作用，降低了亲本基因的转录。这些数据均证明EIciRNA通过与U1 snRNA的相互作用而与U1 snRNP结合，产生的EIciRNAs-U1 snRNP复合体与它们的亲本基因的启动子Pol Ⅱ相互作用，以增强其亲本基因的转录[14]。

2.3 CircRNA的转录潜能

理论上讲,circRNA缺乏像5′帽和3′poly(A)尾巴的结构, 不参与蛋白质编码。然而有研究认为，circRNA的起源来自蛋白质编码序列，其开放阅读框以及某些线性mRNA的帽-独立翻译的存在促使研究人员寻找circRNA翻译的证据[21-22]。研究人员于1995年即发现真核生物转译器可以启动包含内部核糖体进入位点元素的circRNA的翻译[23]。当一个内部核糖体插入含有分裂的GFP的小基因时circRNA会产生GFP蛋白，这表明circRNA可以作为mRNA参与蛋白质的合成[24]。Abe等[25]进一步研究发现，circRNA能通过滚环扩增机制在大肠杆菌(E.coli)翻译系统中得到有效翻译，而在真核生物翻译系统中，circRNA可能通过滚环扩增机制产生丰富的蛋白质产物。然而，建立内源性circRNA翻译的研究尚未报道。综上所述，除了作为miRNA分子海绵外，circRNA的其他功能尚需进一步验证，其调控基因表达的作用机制有待于进一步揭示。

3 CircRNA与疾病的关系

3.1 CircRNA与气道变应性疾病

CircRNA在气道变应性疾病中的直接研究甚少，但miRNA在气道变应性疾病中的作用已得到证实。近年来的研究表明，多种miRNAs参与气道变应性疾病的发病过程，如细胞因子分泌、炎症细胞浸润及气道高反应性等，在其免疫应答和炎症调节方面起着关键作用。其中miR-21、miR-155是研究较多的与免疫系统相关的miRNAs。Lee等[26]研究发现，接受抗miR-21治疗的急性支气管哮喘模型小鼠肺组织中miR-21选择性下调，嗜酸性粒细胞浸润减少，Th2细胞因子(包括IL-4、IL-5和IL-13)的生成减少，同时肺组织中Th2信号通路的转录因子水平降低。这表明miR-21可以抑制Th2的激活以调节免疫应答，对变应性气道炎症的发展具有抑制作用。Namdari等[27]研究显示，miR-21影响CD4、CD25、Foxp3和T cell的产生，是调节性T细胞(Treg)的正性调控者，在体外诱导Treg的生成过程中发挥重要作用。Johansson等[28]提出，变应性气道炎症小鼠模型中，miR-155在变应原诱导的气道炎症模型小鼠中作为2型固有淋巴细胞中IL-33信号转导的正性调控因子对炎症的发生和发展发挥促进作用，miR-155缺乏可以预防慢性变应性气道炎症。另有一些miRNAs是一些气道炎症相关介质的转录调控因子，参与气道炎症反应过程。例如miR-125b在嗜酸粒细胞性CRSwNP中表达上调，通过在气道上皮细胞中抑制EIF4E结合蛋白1(4E-BP1)的表达而增强Ⅰ型干扰素(interferon，IFN)的表达，从而导致嗜酸粒细胞性CRSwNP黏膜中的嗜酸性粒细胞增多。这表明miRNA参与了鼻黏膜上皮细胞变态反应性炎症的调控[29]。miR-146在人气道平滑肌中调节炎症介质的表达，与哮喘的发病机制密切相关[30]。Wu等[31]研究发现，与正常对照组相比，哮喘患者体内miR-126的表达显著上调。在体外随着IL-13质量浓度升高，miR-126在支气管表皮细胞中的表达量增加。miR-126表达的上调与变应性哮喘的发生和治疗有关，故可能是治疗哮喘的疗效指标。因此，这些不同表达的miRNAs有望成为气道变应性疾病的新型诊断生物标志物和潜在的治疗靶点。

CircRNA作为miRNA海绵可能在免疫应答和保护细胞抵御微生物感染中发挥关键的微调作用[32]。ITCH属于泛素连接酶E3家族，其在免疫方面的作用主要是控制T细胞分化和自身免疫功能，而circ-ITCH来源于ITCH基因，富含3个miRNA结合位点，包括miR-7、miR-17、miR-214。Li等[33]通过荧光素酶基因检测证实，circ-ITCH吸附miR-7、miR-17和miR-124，从而使ITCH表达水平升高，故circ-ITCH可能参与免疫反应。此外，为研究circRNA对RAW264.7巨噬细胞中降钙素基因相关肽诱导的IL-6表达的作用，Deng等[34]采用实时定量PCR分析法进行研究，发现mmu_circRNA_007893表达在降钙素基因相关肽预激的巨噬细胞中显著增加，沉默mmu_circRNA_007893后，IL-6 mRNA表达明显降低，而mmu-miR-485-5p表达明显增加。结果表明，降钙素基因相关肽诱导IL-6 mRNA表达的作用由mmu_circRNA_007893所介导，mmu_circRNA_007893作为内源性mmu-miR-485-5p海绵参与在RAW264.7巨噬细胞中降钙素基因相关肽诱导的IL-6 mRNA的表达过程。另有研究表明，在LPS刺激后诱发的应答中，敲除mcircRasGEF1B能影响成百上千个基因的转录和转录后调控，导致大量基因(包括多种免疫相关基因)的功能失调，其中涉及DNA复制、有丝分裂、巨噬细胞活化、核因子κB抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor-κB，IκB/核因子-κB (nuclear factor-κB，NF-κB)信号转导和脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)LPS诱导的免疫应答等[35]。

3.2 CircRNA与其他疾病

目前关于circRNA与癌症关系的研究较为成熟。研究表明，CDR1as/miR-7之间的平衡可能影响一些信号通路，从而调控肿瘤的发生、发展和转移[36]。另有多项研究证实，circRNA可能作为新的生物标志物用于肿瘤疾病的诊断和治疗。Yao等[37]研究发现，与相邻的非肿瘤组织相比，非小细胞肺癌组织中circRNA_100876的表达水平显著升高，在非小细胞肺癌中circRNA_100876表达的上调与淋巴结转移和肿瘤分期之间密切有关，表明circRNA_100876与非小细胞肺癌的发生机制密切相关，可能成为预后判断的生物标志物和治疗靶点。

除了癌症之外，关于circRNA在其他疾病中的作用也有报道。Ng等[32，35]研究显示，LPS诱导的circRNA-mcircRasGEF1B可以通过TLR4/NF-κB信号通路正性调控ICAM-1 mRNAs的表达，敲除mcircRasGEF1B能降低LPS诱导的ICAM-1基因转录和蛋白表达水平，从而影响炎症反应过程。Wan等[38]对LPS诱导的急性呼吸窘迫综合征大鼠肺组织中circRNAs的表达谱进行微阵列分析，发现有957个circRNAs在大鼠肺组织中有差异性表达。同时，circRNA可能通过circRNA-miRNA-gene通路调控mRNA的表达水平。由此可见，circRNA参与多种疾病的发生和发展，其与miRNA的相互作用对于相关疾病发病机制的研究具有重要意义。

综上所述，作为miRNA海绵的circRNA可能通过阻断miRNA对其靶基因的抑制作用而改变miRNA靶基因的表达水平，在转录后层面调控变应性疾病免疫反应及炎症反应，从而调控气道变应性疾病的发生和进展。另外，作为一种竞争性内源性RNA，circRNA可能调节选择性剪接过程，通过它们在与亲本基因剪接竞争的作用促进其亲本基因的转录[13-14,39]，从而与气道变应性疾病相关联。虽然目前我们对circRNA的认识相当有限，但深入开展miRNA在气道变应性疾病中的研究有望揭示circRNA在气道变应性疾病中的免疫调控作用及其机制，并可能作为该疾病基因治疗的新靶点。

4 展望

CircRNA曾被认为是一类因外显子转录过程中发生错误剪接而形成的低丰度RNA分子,因而对它们的研究不够深入。随着生物信息学和RNA测序技术的迅速发展，circRNA现已成为分子生物学领域最新的研究热点，虽然对circRNA的研究才刚刚开始，对其生物学功能和调控机制的研究还面临着许多挑战，但其在多种疾病中的应用前景已初见端倪。CircRNA的发现揭示了一种新的发生在转录后的基因调控层面的基于其作为miRNA海绵和调控基因表达的功能，circRNA将可能成为新一代的生物标志物或治疗靶点。关于circRNA在气道变应性疾病发病中的作用机制及其在基因治疗方面的作用等目前尚不清楚，通过研究circRNA在气道变应性疾病中的潜在生物学功能及其作用机制，探索circRNA与气道变应性疾病的关系将有助于进一步揭示气道变应性疾病发病的病理机制，为该疾病的基因靶向治疗提供新的思路。