重症肌无力患者血清microRNA-146a水平变化及其生物信息学分析

黄攀，徐敏，何晓英,王淳

(1 德阳市人民医院，四川德阳618000；2 德阳市第二人民医院；3 西南医科大学附属医院)

重症肌无力(MG)是一种由于神经-肌肉接头突触后膜上乙酰胆碱受体(AChR)受损导致的神经-肌肉接头传递功能障碍性疾病[1]。其主要临床表现为部分或全身骨骼肌无力，易疲劳，活动后症状加重，充分休息或胆碱酯酶抑制剂治疗后症状可减轻。MG病情易反复并可出现多种危象，给社会和家庭造成沉重负担。目前认为，MG是一种与遗传因素有关的获得性自身免疫性疾病[2]。microRNA是一类长度为17～22个核苷酸的单链小分子物质，通过完全或非完全碱基互补配对原则与特定靶基因mRNA的3′端非编码区结合，从而抑制mRNA翻译或降解其特定mRNA，继而参与机体生长发育、疾病发生的调控[3]。有研究发现，microRNA-146a在多种免疫性疾病中存在差异表达[4，5]，提示其具有调控炎症免疫反应的作用，但鲜见MG患者microRNA-146a差异表达情况的报道。因此，本研究观察了MG患者血清micro-RNA-146a水平变化，并通过生物信息学方法分析microRNA-146a靶基因的功能富集和信号通路富集情况，以期从基因学角度进一步阐述MG的发病机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2015年7月～2018年1月德阳市人民医院收治的MG患者108例(MG组)。纳入标准：①符合重症肌无力诊断和治疗的中国专家共识[6]；②首次确诊且未行治疗；③临床资料完整；④神志清楚，能配合本研究。排除标准：①合并自身免疫性疾病；②正在使用抑制免疫功能的药物；③合并严重内科系统疾病；④合并其他神经-肌肉疾病。其中，男47例、女61例，年龄(37.47±8.21)岁。另选同期体检健康者50例(对照组)，男20例、女30例，年龄(39.25±8.34)岁。两组性别、年龄具有可比性。本研究经德阳市人民医院医学伦理委员会批准，患者或其家属知情同意。

1.2 血清microRNA-146a检测 空腹采集外周静脉血5 mL，室温下自然凝固15 min，3 000 r/min离心30 min，收集上层血清。主要试剂和仪器：TRIzol Reagent、10 mmol/L dNTP Mix、M-MLV逆转录酶购于美国Invitrogen公司；SYBR Premix Ex Taq购于日本TaKaRa公司；三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇购于国药集团化学试剂有限公司；荧光定量PCR仪购于美国Life Technologies公司；PCR仪购于杭州博日科技有限公司；台式离心机购于上海安亭科学仪器厂。检测方法：①血清总RNA提取及质检。取200 μL血清置于冰上融化，加入1 mL TRIzol，充分混匀，静置5 min后加入三氯甲烷250 μL，再充分混匀，置于冰上静置5 min。将上述混合液4 ℃下以10 000 g离心10 min，在超净工作台中小心吸取上清500 μL于1.5 mL EP管中；加入4 ℃预冷的等体积异丙醇，颠倒混匀，-20 ℃静置15 min。将上述溶液在4 ℃下以10 000 g离心10 min，小心弃掉液体；加入1 mL 4 ℃预冷的75%乙醇，颠倒数次，清洗RNA沉淀；再于4 ℃下以10 000 g离心5 min，弃掉液体；于超净工作台中干燥数分钟，将乙醇充分挥发干净，加入10 μL RNase-Free Water溶解RNA。采用核酸蛋白测定仪测定所提取RNA的OD260、OD280值，OD260/OD280为1.8～2.0，表明所提取的RNA纯度较高。②RT-PCR反应。第一链cDNA的合成采用M-MLV逆转录酶试剂盒，将内参基因和目的基因特异性逆转录引物各1.0 μL、dNTP Mix 1.0 μL、RNA 10 μL、5×第一链合成缓冲液4.0 μL、DTT 2.0 μL、M-MLV逆转录酶1.0 μL，按说明书置于反应体系中，按照95 ℃ 5 min、37 ℃ 50 min的方式反转录为cDNA。将前述制备的反应混合液置于96孔板中，按操作步骤加入2×qPCR Mix 5.0 μL、引物工作液1.0 μL、Template 1.0 μL、ddH2O 2.8 μL、Rox 0.2 μL。扩增条件:95 ℃ 1 min;95 ℃、15 s，58 ℃、20 s，72 ℃、45 s，共40个循环。microRNA-146a上游引物5′-CCTGAGAAGTGAATTCCATGGG-3′、下游引物5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3′，内参基因U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3′、下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。每样本设3个复孔。采用2-ΔCt法计算microRNA-146a相对水平。

1.3 microRNA-146a生物信息学分析 采用美国加州大学圣克鲁兹分校研制的UCSC基因组在线工具(http://genome-asia.ucsc.edu)分析microRNA-146a在人类基因组中的位置及保守性；运用Targetscan数据库(http://www.targetscan.org/vert_72/)及CoMeTa数据库(https://www.cometasystems.com/)预测microRNA-146a的靶基因；采用DAVID数据库分析microRNA-146a靶基因的功能富集(GO富集)和信号通路富集(KEGG Pathway)。

2 结果

2.1 两组血清microRNA-146a水平比较 MG组血清microRNA-146a相对水平为2.13±0.63，高于对照组的0.86±0.38(P<0.05)。

2.2 microRNA-146a在人类基因组中的位置及保守性 microRNA-146a定位于5q33.3人染色体上160485325～160485450，长度为99 bp，并且其核苷酸序列在人、恒河猴、小鼠、狗、大象、鸡6个物种中高度保守。

2.3 microRNA-146a靶基因预测结果 使用Targetscan数据库预测microRNA-146的靶基因共251个，而CoMeTa数据库预测靶基因共939个。两个数据库同时出现的靶基因有88个(ERBB4、IRAK1、WWC2、TAF9B、USP47、ABL2、BMPR1A、CDC14A、CLCN6、RNF32、ZNF148、MYO6、MARK1、SORT1、IGSF1、MMP16、SLC2A3、SEC23IP、CNTF、NRP2、QKI、BAG1、ARMC8、RARB、TDRKH、NRAS、FRYL、FBXW2、GRSF1、C10orf76、PHOX2B、MYT1、CAMSAP1、FLOT2、CCDC6、STC1、SEMA3G、TCF21、TANC2、LTB、EDNRB、ROBO1、EIF5A2、RABGAP1、RUNX1T1、LRRC15、SMAD4、VAT1、POU3F2、LFNG、BNC1、MYBL1、SYT1、SIAH2、TRAF6、DGKG、KLF7、CD80、CDON、BCORL1、CARD10、DNPEP、SLI1、TRK3、RNASEL、C16orf72、LRP2、PRX、KCMF1、NUMB、KIF24、ZNF532、PPP1R11、RIMS2、NOVA1、DLGAP2、SH3GL2、EIF4G2、MFHAS1、FBXO28、KPNA6、NF2、STRN、CASK、PBX2、SLC10A3、USP3、SCN3B、PGK1)。这些靶基因在基因转录、免疫球蛋白、炎症反应、钙调素调节蛋白生成、突触分化等过程中发挥重要作用。

2.4 microRNA-146潜在靶基因的功能富集 采用DAVID数据库对88个交集潜在靶基因进行功能富集分析，发现microRNA-146a靶基因功能主要富集于细胞增殖调控、神经元分化、磷代谢反应、免疫炎症反应、细胞因子合成等22个生物学过程中。见表1。

表1 microRNA-146a靶基因GO分析结果

2.5 microRNA-146潜在靶基因的信号通路富集 microRNA-146a靶基因主要富集于Toll样受体信号通路、肿瘤信号通路、神经递质调节信号通路、病毒性心肌炎信号通路、EB信号通路5条信号通路中。其中，Toll受体是一种与免疫及炎症反应密切相关的信号通路，且已经被证实与MG发病有关。见表2。

3 讨论

1895年Jolly首次命名了MG，其后相关报道逐渐增多[7]。MG最初被认为是一种AChR抗体介导的自身免疫性疾病，该抗体可引起突触后膜大量的AChR被破坏，进而导致终板电位不能产生，最终因突触后膜传递功能障碍而出现肌无力表现[8]。近年来，随着家族性MG的发现，人们逐渐认识到MG与人类白细胞抗原关系密切，由此推测MG是一种与遗传因素密切相关的自身免疫性疾病[9，10]。但目前MG与遗传因素的研究较少。因此，有必要进一步对MG发病的遗传因素进行研究。

表2 microRNA-146a潜在靶基因KEGG Pathway结果

microRNA是一类具有重要调控作用的非编码小分子RNA，在人体内通过与其特定靶基因的结合，进而发挥调控多条信号通路的作用，免疫炎症反应信号通路便是其中之一。microRNA-146a被认为具有调控免疫炎症反应的作用。有研究发现，microRNA-146a可通过抑制TRAF6/NF-κB信号通路减轻腰椎间盘的炎症反应[11]；另有研究发现，在阿尔茨海默病患者脑中，下调的microRNA-146a可以通过TLR信号途径促进固有免疫反应，进而促进阿尔茨海默病的发生[12]。本研究中，通过对比MG患者和体检健康者外周血清microRNA-146a水平发现，MG患者血清microRNA-146a水平明显高于体检健康者，提示microRNA-146a可能与MG的发病密切相关，这与Yan等[13]的研究结论相似。

microRNA通过与特定靶基因mRNA结合进而发挥相应的生物学功能。为进一步明确microRNA-146a潜在的靶基因，我们采用生物信息学方法进行预测。目前，microRNA靶基因的预测数据库众多，TargetScan数据库和CoMeTa数据库是较为常用的两种。本研究通过绘制Venn图[14]，取以上两种数据库的交集作为microRNA-146a潜在靶基因，大大提高了预测的准确性；结果发现，microRNA-146a潜在的靶基因有ERBB4、NUMB、CD80、TRAF6、IRAK1等88种。神经调节蛋白(NRG)是一种神经元来源的营养因子，具有支持神经肌肉发育的作用，而ERBB4则是NRG的受体之一[15]。此外，NRG-ERBB4信号通路还在突触的形成及轴突导向的调节等过程中发挥重要作用。有研究还发现，microRNA-146a可以调控ERBB4的表达，进而抑制胃癌细胞的转移和增殖[16]。p53是一种众所周知的抑癌基因，NUMB基因的表达产物NUMB蛋白可以抑制p53的活性进而增加小肠腺癌组织中的免疫活性[17]。T细胞的活化是免疫应答反应的重要过程，而免疫突触的形成在T细胞活化过程中具有重要作用，CD80是免疫突触形成过程中重要的协同刺激分子[18]。TRAF6是TLR信号通路的主要介导因子，广泛参与介导炎症与免疫反应[19]。IRAK1是介导免疫和炎症反应的TLR和白细胞介素1受体信号通路中的重要分子[20]。

对靶基因进行功能富集分析和KEGG信号通路分析，有利于寻找和预测与疾病发生有关的分子调控网络。DAVID6.7数据库是常用的预测软件。本研究采用DAVID数据库对microRNA-146a靶基因功能GO富集发现，相关靶基因分子主要富集于细胞增殖调控、神经元分化、磷代谢反应、免疫炎症反应、细胞因子合成等生物学过程中；而KEGG Pathway结果显示，microRNA-146a主要富集于TLR[21]、神经递质调节、病毒性心肌炎、EB等多个信号传导通路。研究表明，TLR家族中的TLR9与MG发病关系密切，TLR9可以通过TRAF6和CD88途径促进INF-α表达，进一步激活自身反应性淋巴细胞，从而导致MG的发病[22]。有研究发现，MG患者胸腺组织EB病毒含量较正常人增高，提示EB病毒与自身免疫性疾病有一定关系，但具体关系还需进一步研究证实[23，24]。

综上所述，MG患者血清microRNA-146a水平升高；通过生物信息学方法分析发现，microRNA-146a可能通过调控多条信号通路中的多种靶基因，参与MG的发病。这为进一步阐明MG发病过程中的分子调控网络提供了更多的依据。但本研究样本量较少且为单中心研究，其结论可能存在一定偏倚，今后需更多大样本、多中心研究进行验证。