生物钟基因在腹部恶性肿瘤组织中的表达差异

邱梦君，熊枝繁，何晓晓，毕柠瑞，汪朦朦，杨盛力

(1华中科技大学同济医学院附属梨园医院，武汉430077；2贵州医科大学附属医院；3华中科技大学同济医学院附属协和医院)

生物钟是生物在漫长进化过程中形成的稳定内在生物节律，在分子水平上由许多生物钟基因调控，如Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Timeless、CLOCK、BMAL1、NPAS2、NR1D1、NR1D2、DEC1和DEC2[1]。生物钟基因在分子水平上协调表达，通过机体新陈代谢来调节细胞和器官的生长、衰老[2]。肿瘤的发生是由于机体在基因水平上失去了对细胞生长正常的调控作用，从而导致细胞增殖紊乱。生物钟基因通过调控细胞增殖和凋亡，在肿瘤的发生、发展中发挥直接或间接作用[3]。2018年1～6月，本研究采用癌症基因组图谱(TCGA)数据库分析生物钟基因在腹部恶性肿瘤组织与邻近正常组织中的表达差异，初步探讨生物钟基因在腹部恶性肿瘤中的潜在作用。

1 材料与方法

1.1 材料 从TCGA网站(https://cancergenome.nih.gov/)下载最新14个生物钟基因(Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Timeless、CLOCK、BMAL1、NPAS2、NR1D1、NR1D2、DEC1、DEC2和RORA)在6种腹部恶性肿瘤(胃癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、直肠癌和肾癌)组织中的RNA-Seq数据，包括371例份肝癌与50例份邻近正常组织，538例份肾癌与72例份邻近正常组织，478例份结肠癌与41例份邻近正常组织，166例份直肠癌与10例份邻近正常组织，375例份胃癌与32例份邻近正常组织，177例份胰腺癌与4例份邻近正常组织。

1.2 研究方法 用Bioconductor (http://www.bioconductor.org/)的edgeR去标准化RNA-Seq数据。恶性肿瘤组织和邻近正常组织均以标准化RNA-Seq数据表达量的平均值为基础，比平均值高的为高表达，比平均值低的为低表达。

1.3 统计学方法 采用SPSS23.0统计软件。生物钟基因在恶性肿瘤组织与邻近正常组织中的差异表达比较采用Pearson卡方检验。采用GraphPad Prism5对数据进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

在不同的腹部恶性肿瘤组织中，生物钟基因表达不一。14个生物钟基因在肝癌、肾癌、结肠癌、直肠癌、胃癌组织中均低表达，其中Cry2、CLOCK、Timeless、NPAS2、NR1D1、DEC1、DEC2、RORA在肝癌组织中的表达低于其邻近正常组织(P均<0.05)，Per1、Per2、Cry1、Cry2、CLOCK、Timeless、NPAS2、NR1D1、NR1D2、DEC2、RORA在肾癌组织中的表达低于其邻近正常组织(P均<0.05)，Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Timeless、BMAL1、NR1D2、DEC1、DEC2、RORA在结肠癌组织中的表达低于其邻近正常组织(P均<0.05)，Per1、Per3、Cry1、Cry2、CLOCK、BMAL1、NPAS2、NR1D1、DEC2、RORA在直肠癌组织中的表达低于其邻近正常组织(P均<0.05)，Per1、Per3、Cry2、CLOCK、Timeless、BMAL1、NPAS2在胃癌组织中的表达低于其邻近正常组织(P均<0.05)。14个生物钟基因在胰腺癌组织的表达与其邻近正常组织比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

3 讨论

生物钟是通过参与生理、生化、行为过程而获得的、调控机体昼夜周期的内在系统[4]，包括中枢生物钟和外周生物钟。中枢生物钟是节律的起点，可自主产生并维持日周期节律，由此发出的信息控制机体的生理节律，包括睡眠觉醒、血压、心率、呼吸、体温、脏器活动、激素和神经内分泌活动、细胞分裂等。外周生物钟受中枢生物钟直接或间接控制，但在失去中枢生物钟的控制后，外周生物钟亦可以独立启动，表现为细胞代谢和增殖的昼夜节律[5，6]。生物钟基因通过调节许多下游基因来影响细胞的生命。在哺乳动物的基因组中，生物钟基因调控2%～10%基因的表达，这些基因被称为时钟控制基因[7，8]。生物钟基因的异常表达可通过对下游时钟控制基因的调控，导致肿瘤、内分泌疾病、心血管疾病等疾病的发生[9，10]。

细胞周期基因亦可呈现昼夜节律，各种不同的细胞周期蛋白控制着细胞周期的各个阶段。生物钟基因的表达和特定的细胞周期阶段具有相关性[11，12]。本研究发现，14个生物钟基因在6种腹部恶性肿瘤癌组织中均低表达，表明生物钟基因表达下调可能导致细胞周期基因下调，干扰细胞周期的不同阶段，可造成恶性肿瘤细胞周期改变，使细胞呈现不受控制的异常增殖状态。此外，生物钟基因在恶性肿瘤组织中的表达异常可通过调控癌基因、抑癌基因、细胞周期蛋白、血管内皮生长因子等时钟控制基因参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、转移、侵袭及肿瘤新生血管形成等生物学过程[4]。据报道，Per2基因低表达会引起p53、Bax和Timp-2基因表达下调，Ki-67、Mdm2、c-Myc和Bcl-2基因表达上调[7，13]。有研究还发现，Per2亦能抑制血管内皮生长因子的转录[13]，从而抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞增殖。炎症因子是肿瘤形成的重要介质，而人体的免疫系统可以清除炎症因子，在肿瘤的发生、发展中具有重要的屏障作用。有研究发现，炎症因子和血液中的B细胞、T细胞、NK细胞等免疫细胞介导的细胞和体液免疫均具有明显的节律性。因此，当生物钟基因紊乱导致昼夜节律失衡后，炎症反应暴发，免疫系统失去稳定性，导致肿瘤细胞不受控制和病情恶化[14，15]。

表1 14个生物钟基因在腹部恶性肿瘤组织及邻近正常组织中的表达比较(例份)

细胞内的生物节律是生物钟基因通过两个重要的反馈回路实现的[16]。生物钟基因存在两个重要的反馈回路。①CLOCK与BMAL1形成CLOCK/BMAL1转录复合体，随后通过与Per1～3和Cry1、2基因启动子上的E-box结合，激活其转录。编码的Per1～3和Cry1、2蛋白会形成一个多聚体，由细胞质转移至细胞核内，与CLOCK/BMAL1直接结合并抑制其活性，进而阻遏Per1～3和Cry1、2的转录，Per1～3和Cry1、2蛋白的降解会重新启动CLOCK/BMAL1的转录，开始一个新的昼夜节律周期。②CLOCK与BMAL1形成的异二聚体激活孤儿核受体Rev-Erb基因的转录。Rev-Erb基因编码蛋白可再与BMAL1启动子相结合并阻遏其转录。除了转录调控外，转录后基因的修饰也参与了昼夜节律蛋白的调控。有研究发现，生物钟基因的表达在邻近正常组织中趋势不一，一方面可能是因为下游生物钟基因表达水平的差异，通过反馈回路反应性地增加或降低上游生物钟的表达水平；另一方面可能是因为本研究邻近正常组织样本量太少，存在误差。

综上所述，生物钟基因异常表达在腹部恶性肿瘤组织中普遍存在。然而，导致这些恶性肿瘤组织生物钟基因表达差异的具体机制及如何精确地促进恶性肿瘤发生、发展仍不清楚。生物节律紊乱可能导致恶性肿瘤的发生，恶性肿瘤的发生也可能影响生物钟基因的表达。阐明生物钟基因与恶性肿瘤的联系，将有利于恶性肿瘤新治疗策略的发展，并为临床指导时辰治疗、评估疾病预后等提供依据。将来，生物钟基因有可能使时辰治疗成为一种更为合理的肿瘤治疗模式。