沉默长链非编码RNA HOTAIR对膀胱癌细胞增殖、凋亡的影响及其机制

刘泓键，奉友刚，余周，康永明，贺炜，姜明东

(遂宁市中心医院,四川遂宁629000)

膀胱癌是最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一，以膀胱移行性细胞癌最常见[1]。膀胱移行性细胞癌具有易侵袭、转移和复发等生物学特性，但目前对膀胱癌的发病机制尚不明确。长链非编码RNA(LncRNA)的转录本长度超过200 nt，位于细胞核或细胞质中，因缺乏开放阅读框架而无法编码蛋白质。研究认为，LncRNA与物种进化、胚胎发育、物质代谢以及肿瘤发生等有关[2]。LncRNA可在表观遗传学、转录或转录后水平等参与染色体的修饰、转录、翻译等过程[3]。HOTAIR是一个长2 158 nt的反义LncRNA，其反式调控位点不在染色体的HOX基因簇，因而无法调控编码该LncRNA自身的HOX基因簇[4]。HOTAIR一直被认为是一种原癌基因，在多种肿瘤组织中过表达，与肿瘤的发展、浸润、转移和不良预后有关[5]。HOTAIR可作为多梳抑制复合体2与组蛋白去甲基化酶的分子支架，通过调控组蛋白H3K27甲基化和H3K4去甲基化水平，使肿瘤转移抑制基因表达沉默，同时诱导肿瘤转移正向调控基因表达，从而促进肿瘤转移[6]。Notch信号通路蛋白1(Notch1)、上皮细胞黏附分子(EpCAM)、趋化因子受体2(CXCR2)、上皮性黏附蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)基因与细胞增殖、凋亡等密切相关。目前，关于HOTAIR对膀胱癌细胞增殖、凋亡影响的报道较少。2017年5月～2018年3月，我们观察了沉默LncRNA HOTAIR对膀胱癌细胞增殖、凋亡的影响，并探讨其作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 膀胱癌253J细胞株购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。DMEM，江苏凯基生物技术股份有限公司；FBS，以色列BI公司；si-HOTAIR(可沉默HOTAIR表达)及空载体阴性序列(Vector)均由上海生工生物工程股份有限公司合成，si-HOTAIR序列上游引物5′-GATCCGCCTTTG-GAAGCTCTTGAAGGCTCGAGCCTTCAAGAGCTTCC-AAAGGCTTTTTG-3′，下游引物5′-AATTCAAAAAGC-CTTTGGAAGCTCTTGAAGGCTCGAGCCTTCAAGAG-CTTCCAAAGGCG-3′；Vector上游引物5′-GATCC-TTCTCCGAACGTGTCACGTAATTCAAGAGATTACGT-GACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3′，下游引物5′-A-ATTCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAATCTCT-TGAATTACGTGACACGTTCGGAGAAG-3′。TRIzon Reagent、Ultrapure RNA超纯RNA提取试剂盒、HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒、UltraSYBR Mixture，北京康为世纪生物科技有限公司；荧光定量PCR仪，伯乐生命医学产品(上海)有限公司；荧光显微镜，日本Olympus公司。

1.2 细胞分组及si-HOTAIR干扰方法 取适量对数生长期253J细胞，随机分为si-HOTAIR干扰组、空载体组、对照组，每组设6个复孔，待细胞生长融合达90%时，si-HOTAIR干扰组、空载体组分别转染si-HOTAIR、Vector，对照组不做任何处理，然后将各组细胞放回孵箱继续培养，转染4 h更换为含血清的完全培养基培养。

1.3 各组细胞增殖情况观察 采用CCK-8法。取各组转染4 h细胞，弃培养基，每孔加入新配制的CCK-8溶液10 μL，继续培养4 h。采用酶标仪检测各组450 nm波长处的光密度(OD)值。以OD450值代表细胞增殖能力。实验重复3次，取平均值。

1.4 各组细胞凋亡情况观察 采用Hoechst法。取各组转染4 h细胞，固定，Hoechst 33258染色液染色5 min。充分混匀，振荡洗涤，于载玻片上加入相应的抗荧光淬灭封片液，荧光显微镜下观察，正常细胞的细胞核呈正常蓝色，而凋亡细胞的细胞核呈致密浓染或呈碎块状致密浓染，计数凋亡细胞数。实验重复3次，取平均值。

1.5 各组细胞Notch1、EpCAM、CXCR2、E-cadherin、Vimentin、MMP-2和α-SMA mRNA表达检测 采用实时荧光定量PCR法。取各组转染4 h细胞，TRIzol法提取总RNA,RQ1 RNase-Free DNase去除基因组DNA，NanoDrop2000检测RNA浓度。根据Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis kit建立20 μL反应体系，将总RNA逆转录为cDNA。严格按照SYBR Green PCR试剂盒说明书进行PCR扩增。引物序列：Notch1上游引物5′-CTTTGTGCTTCTGTTCTTCGTG-3′，下游引物5′-CGCCGCTTCTTCTTGCT-3′；EpCAM上游引物5′-TTCGGGCTTCTGCTTGC-3′，下游引物5′-CCCTTCAGGTTTTGCTCTTC-3′；CXCR2上游引物5′-ATGTCTCAGCATCTGGGGTCT-3′，下游引物5′-GCAGGGTGAATCCGTAGCA-3′；E-cadherin上游引物5′-ATCTGAAAGCGGCTGATACTG-3′；下游引物5′-TGCCCCATTCGTTCAAGTA-3′；MMP-2上游引物5′-CCGCAGTGACGGAAAGA-3′，下游引物5′-TGGTGTAGGTGTAAATGGGTG-3′；Vimentin 上游引物5′-TCGTGATGCTGAGAAGTTTCG-3′，下游引物5′-TCTGGATTCACTCCCTCTGGT-3′；α-SMA上游引物5′-GCGTGGCTATTCCTTCGT-3′，下游引物5′-TCAGGCAACTCGTAACTCTTCT-3′；GAPDH上游引物5′-CAATGACCCCTTCATTGACC-3′，下游引物5′-GAGAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′。反应体系：RNase Free dH2O 9.5 μL，cDNA/DNA 1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，2×UltraSYBR Mixture 12.5 μL；反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s共40个循环。以GAPDH为内参，以2-ΔΔCt法计算HOTAIR、Notch1、EpCAM、CXCR2、E-cadherin、Vimentin、MMP-2和α-SMA mRNA相对表达量。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 各组细胞增殖能力比较 转染4 h，si-HOTAIR干扰组、空载体组、对照组细胞增殖能力分别为0.38±0.02、0.89±0.01、0.89±0.02。与对照组、空载体组比较，si-HOTAIR组细胞增殖能力明显下降(P均<0.05)，而对照组与空载体组比较P>0.05。

2.2 各组凋亡细胞数比较 转染4 h，si-HOTAIR干扰组、空载体组、对照组凋亡细胞数分别为(33.56±2.26)、(13.69±1.25)、(12.85±1.35)个。与对照组、空载体组比较，si-HOTAIR组凋亡细胞数明显升高(P均<0.05)，而对照组与空载体组比较P>0.05。

2.3 各组细胞Notch1、EpCAM、CXCR2、E-cadherin、Vimentin、MMP-2和α-SMA mRNA表达比较 见表1。

表1 各组细胞Notch1、EpCAM、CXCR2、E-cadherin、Vimentin、MMP-2和α-SMA mRNA相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与空载体组比较，#P<0.05。

3 讨论

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，具有易侵袭、转移和复发等生物学特性，但其病因及发病机制尚不十分清楚。

HTOAIR是一种由2 158个碱基组成的长链非编码RNA，是一种原癌基因，在多种肿瘤组织中过表达，与肿瘤的发展、浸润、转移和不良预后有关。Gupta等[7]研究发现，HTOAIR与多梳抑制复合体2结合，可诱导H3组蛋白的第27位赖氨酸甲基化，造成JAM2、PCDH10和PCDHB5等肿瘤转移抑制基因在表观遗传水平上达到基因沉默的效果。Wu等[8]观察HOTAIR与肾癌细胞增殖和肿瘤形成的关系发现，随HOTAIR表达增加，肾癌细胞增殖能力显著增强，p16、p21、p53等细胞周期相关蛋白表达异常；进一步动物实验发现，裸鼠肿瘤重量亦显著增加；基因芯片检测表明，敲除HOTAIR基因可减弱HOTAIR招募H3K27me3后结合蛋白的能力。Yang等[9]研究发现，HOTAIR高表达与肝癌的转移和复发以及肝癌细胞的耐药性密切相关。本研究结果发现，与对照组、空载体组比较，si-HOTAIR组细胞增殖能力明显下降，凋亡细胞数明显升高，说明下调HOTAIR表达可抑制膀胱癌细胞增殖并促进其凋亡。

Notch基因在各种生物体内广泛存在，并具有高度同源性[10]。Notch及其相关基因在进化上高度保守，在细胞分化和胚胎发育中发挥重要作用。本研究结果发现，与对照组、空载体组比较，si-HOTAIR组Notch1 mRNA相对表达量下降，说明HOTAIR可能通过影响Notch1表达影响细胞凋亡。EpCAM可通过激活cyclin A/E、c-myc基因等相关原癌基因的表达，从而起到致瘤作用[11]。EpCAM在鳞癌、乳腺癌等多种上皮性相关肿瘤组织中高表达，可作为上皮性肿瘤诊断和治疗的一种候选蛋白。本研究结果发现，与对照组、空载体组比较，si-HOTAIR组EpCAM mRNA相对表达量下降，表明EpCAM表达降低可能通过抑制某些原癌基因表达起抑瘤作用。E-cadherin是一种钙依赖性细胞黏附分子，通过同型细胞连接维持细胞形态结构完整性，E-cadherin蛋白表达降低也是EMT的一个重要标志[12]。Vimentin属于中间丝蛋白，具有维持细胞与细胞器的形态、信号传导、移植免疫及细胞调亡等多种生物学功能[13]。Vimentin表达异常能够使细胞骨架蛋白构成明显改变，上皮细胞的形态从立方形发展为纺锤形的纤维样细胞，因此会易于迁移和游走。α-SMA能够调节细胞运动。有研究表明，α-SMA表达可促使EMT改变，而EMT可参与生长发育、损伤修复、肿瘤转移和多种纤维化疾病的发生、发展过程[14]。本研究结果发现，与对照组、空载体组比较，si-HOTAIR组Vimentin、α-SMA mRNA相对表达量均明显下降，E-cadherin mRNA相对表达量明显升高，说明HOTAIR可通过影响E-cadherin、Vimentin和α-SMA表达，进一步调控膀胱癌的生物学特征。趋化因子CXC家族有5种受体，CXCR1和CXCR2均为趋化因子受体，其在乳腺癌、结肠癌、膀胱癌等细胞中均过表达，抗体封闭CXCR1和CXCR2则可抑制肿瘤生长和转移[15]。本研究结果发现，与对照组、空载体组比较，si-HOTAIR组CXCR2 mRNA相对表达量下降，说明HOTAIR可通过下调CXCR2表达，进一步影响肿瘤生长。MMPs是一类锌离子依赖性内肽酶，能够降解细胞外基质，从而促进肿瘤的浸润和转移。MMP-2是MMPs比较重要的一个亚型，在乳腺癌、卵巢癌及鼻咽癌等组织中高表达[16]。本研究结果发现，与对照组、空载体组比较，si-HOTAIR组MMP-2 mRNA相对表达量下降，说明HOTAIR可能通过影响MMP-2的表达，参与膀胱癌的转移。

综上所述，沉默LncRNA HOTAIR表达可抑制膀胱癌细胞增殖并促进其凋亡，其作用机制可能与抑制Notch1、EpCAM、CXCR2、Vimentin、MMP-2和α-SMA表达，促进E-cadherin表达有关。