炎症性肠病患者外周血单个核细胞中miR-146a表达变化及其与病情的关系

郭艳，王云溪，高琦，魏小娟

(新乡市中心医院，河南新乡453000)

炎症性肠病(IBD)作为消化系统常见的非特异性炎症性病变，主要包括克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)，近年来其发病率呈明显上升趋势[1]。IBD的病因和发病机制不明，以腹痛、腹泻、肠梗阻、肠穿孔等为主要临床表现，被认为是结直肠癌的癌前病变[2]。在对IBD进行临床诊断及病情评估时，常在排除感染及其他非感染性结肠炎基础上，根据临床症状及消化道内窥镜检查、病理检查结果综合判定。上述检查不仅操作复杂、费用高，而且为侵入性检查，部分患者耐受性差[3]。因此，积极寻找一种方便、经济、可靠的方法用于IBD诊断及病情评估已成为临床研究的重点。研究表明，黏膜免疫功能紊乱与IBD密切相关[4]。微小RNA-146a(miR-146a)作为一种高度保守的短链非编码RNA，在与靶基因结合后，可在转录后水平调控基因表达，与炎症反应及免疫稳态密切相关[5]，在多种炎症性疾病的发生、发展中具有重要作用[6]。本研究观察了IBD患者外周血单个核细胞中miR-146a表达变化，并探讨其与炎症活动度的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年2月～2017年10月在新乡市中心医院就诊的IBD患者137例。纳入标准：①符合《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见(2012年，广州)》[7]中IBD的诊断标准；②就诊前30天未使用过糖皮质激素、水杨酸抑制剂、免疫抑制剂。排除急慢性感染者、自身免疫系统疾病者、内分泌系统疾病者以及肝肾等重要脏器严重功能障碍者。其中，男73例、女64例，年龄19～65(40.8±9.3)岁；BMI(21.6±1.5)kg/m2。UC患者63例(UC组)，男29例、女34例，年龄19～64(42.0±9.8)岁，BMI(21.6±1.7)kg/m2，病程(38.3±12.5)个月，病变部位:右半结肠28例、左半结肠35例；CD患者74例(CD组)，男44例、女30例，年龄20～65(39.8±8.8)岁，BMI(21.5±1.4)kg/m2，病程(30.8±15.4)个月，病变部位:右半结肠45例、左半结肠29例。UC组与CD组临床资料具有可比性。另选取疑似IBD而经临床检查排除的健康者50例作为对照组，男29例、女21例，年龄(39.6±9.1)岁，BMI(21.3±1.3)kg/m2。UC组、CD组和对照组性别、年龄、BMI具有可比性。本研究经新乡市中心医院医学伦理委员会批准，所有研究对象知情同意。

1.2 外周血单个核细胞分离及miR-146a表达检测 留取三组晨起空腹肘静脉血5 mL，置于EDTA抗凝管内，300 g离心，留取血浆，用等体积PBS稀释，加入人淋巴细胞分离液，160 g离心15 min，留取白细胞层，加入5倍体积PBS，160 g离心10 min，留取沉淀，即为外周血单个核细胞，- 80 ℃冰箱保存。取外周血单个核细胞，加入细胞裂解液，按照TRIzol总RNA提取试剂盒说明提取总RNA，采用核酸凝胶图像分析仪进行电泳分析，用分光光度计检测纯度，以A260/A280为1.80～2.20，表明提取的总RNA合格。按逆转录试剂盒说明将总RNA逆转录为cDNA，在实时荧光定量PCR仪上按照PCR扩增试剂盒说明进行扩增。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。miR-146a上游引物5′-ACACTCCAGCTGGGTGAGAACTGAATTCCATA-3′，下游引物5′-TGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反应条件：94 ℃ 3 min，92 ℃ 30 s、92 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、75 ℃ 30 s共循环38次。每样品设6个复孔。采用2-ΔΔCt法计算miR-146a相对表达量。

1.3 C-反应蛋白(CRP)、红细胞沉降率(ESR)检测及疾病活动度、内镜下病变严重程度评估 采用ELISA法检测血清CRP，采用自动血沉测定仪检测ESR。根据改良Mayo评分标准[7]评估UC患者活动度，其中缓解10例、轻度活动19例、中度活动22例、重度活动12例；根据CD活动指数(CDAI)[8]评估CD患者活动度，其中缓解14例、轻度活动17例、中度活动24例、重度活动19例。采用修正Baron评分系统[9]和CD内镜严重程度指数(CDEIS)[9]分别评估UC、CD患者内镜下病变严重程度。

2 结果

2.1 各组外周血单个核细胞中miR-146a表达比较 IBD患者外周血单个核细胞中miR-146a相对表达量为1.80±0.17，其中UC组、CD组分别为1.76±0.16、1.97±0.23，对照组为1.04±0.10。IBD患者外周血单个核细胞中miR-146a相对表达量高于对照组，且CD组高于UC组(P均<0.05)。UC组和CD组活动期外周血单个核细胞中miR-146a相对表达量高于缓解期，轻度活动者、中度活动者、重度活动者miR-146a相对表达量依次升高(P均<0.05)。见表1。

表1 UC组与CD组外周血单个核细胞中miR-146a表达比较

注：与同组缓解期比较，aP<0.05；与同组轻度活动者比较，bP<0.05；与同组中度活动者比较，cP<0.05。

2.2 IBD患者miR-146a表达与CRP、ESR、疾病活动度、病变严重程度的相关性 UC组外周血单个核细胞中miR-146a相对表达量与CRP、ESR、Mayo评分和修正Baron评分均呈正相关关系(r分别为0.297、0.338、0.661、0.548，P均<0.05)；CD组外周血单个核细胞中miR-146a相对表达量与CRP、ESR、CDAI、CDEIS均呈正相关关系(r分别为0.351、0.427、0.772、0.614，P均<0.05)。

2.3 外周血单个核细胞中miR-146a表达对IBD疾病活动度的预测价值 外周血单个核细胞中miR-146a表达预测UC患者中重度活动度的ROC曲线下面积为0.884(95%CI：0.781～0.987)，其cut off值为1.64，此时其预测UC患者中重度活动度的敏感性为86.8%、特异性为80.0%。外周血单个核细胞中miR-146a表达预测CD患者中重度活动度的ROC曲线下面积为0.980(95%CI：0.955～1.000)，其cut off值为1.77，此时其预测CD患者中重度活动度的敏感性为91.7%、特异性为100.0%。见图1、2。

图1 外周血单个核细胞中miR-146a表达对UC患者中重度活动度的预测价值

图2 外周血单个核细胞中miR-146a表达对CD患者中重度活动度的预测价值

3 讨论

IBD作为一种慢性肠道炎症性疾病，缓解期和活动期交替反复，病情迁延难愈，严重影响患者生活质量[10]。IBD病因及发病机制尚未明确，一般认为与环境、基因、免疫等因素有关[11]。目前，临床上诊断及评估IBD疾病活动度主要依靠内镜活检，但内镜活检具有创伤性，且不能动态观察患者病情。CRP和ESR是临床常用监测IBD的生物学指标，但敏感性和特异性较低，且易受机体其他因素或疾病的影响[12]。因此，亟需寻找一种可用于监测IBD活动度的敏感指标，以指导临床治疗。

近年研究认为，IBD是一种自身免疫性疾病，肠道黏膜免疫功能异常与IBD发病密切相关[13]。miRNA作为一种高度保守的非编码短链RNA，在免疫炎症反应[14]、自身免疫性疾病[15]等的发生、发展中具有重要作用。miR-146a是miRNA的重要类型，已被证实可参与自身免疫性疾病的发生过程[16]。本研究结果显示，IBD患者外周血单个核细胞中miR-146a相对表达量高于对照组，提示miR-146a可能参与IBD的发病过程。

UC和CD是IBD的主要疾病类型，患者临床症状相似，但治疗手段及并发症不尽相同[17]，且二者基因谱表达及细胞表现差异明显[18]。本研究结果显示，CD患者外周血单个核细胞中miR-146a相对表达量高于UC患者，说明miR-146a表达在CD患者和UC患者中存在明显统计学差异。分析原因，可能与CD病变可累及整个消化道及病理改变较重有关[19]。Spearman相关分析结果显示，UC患者miR-146a相对表达量与CRP、ESR、改良Mayo评分和修正Baron评分均呈正相关关系，CD患者miR-146a相对表达量与CRP、ESR、CDAI和CDEIS均呈正相关关系，说明无论是UC还是CD，外周血单个核细胞中miR-146a表达均与患者疾病活动度有关。ROC曲线分析显示，miR-146a表达预测UC患者中重度活动度的曲线下面积为0.884(95%CI：0.781～0.987)，其cut off值为1.64，此时其预测UC患者中重度活动度的敏感性为86.8%、特异性为80.0%；miR-146a表达预测CD患者中重度活动度的曲线下面积为0.980(95%CI：0.955～1.000)，其cut off值为1.77，此时其预测CD患者中重度活动度的敏感性为91.7%、特异性为100.0%。上述结果说明，miR-146a可作为预测UC和CD活动度的指标，当UC、CD患者外周血单个核细胞中miR-146a相对表达量分别达到1.64、1.77时，高度怀疑患者处于疾病活动期。

综上所述，IBD患者外周血单个核细胞中miR-146a高表达，且CD患者miR-146a表达高于UC患者；miR-146a表达与IBD疾病活动度和病变严重程度有关，有望成为评估IBD疾病活动度的指标。但本研究样本量较少且为单中心研究，其结论准确性尚需进一步扩充样本量、开展多中心研究加以验证。