非小细胞肺癌组织Beclin1、LC3表达变化及其临床意义

张秀义，许浩然，孙亚东

(承德市中心医院，河北承德067000)

肺癌的发病率和病死率均居恶性肿瘤前三位，已成为严重威胁人类健康的公共卫生问题之一。绝大多数肺癌患者确诊时已属晚期，预后极差。有研究发现，细胞周期控制基因突变导致正常细胞增殖调节失控及机体抗凋亡功能异常亢进是肿瘤形成的重要原因。细胞自噬是将细胞内折叠错误、老化的蛋白质及受损后失去作用的细胞器在溶酶体内降解的过程[1]。自噬作为一种细胞内大分子物质的降解通路，是真核细胞所特有的代谢途径。当肿瘤细胞增殖过度活跃时，会促进肿瘤细胞自噬性凋亡，抑制肿瘤生长。机体内存在多种自噬调控基因，其功能异常引起的细胞自噬活性改变与肿瘤发生、发展密切相关。自噬相关蛋白Beclin1主要诱导自噬的启动，是自噬中最重要的正向调节因子。微管相关蛋白1轻链3(LC3)是惟一定位于自噬泡内膜的自噬相关蛋白，主要作用是促进自噬小体的成熟，其表达变化可反映细胞自噬活性。本研究观察了非小细胞肺癌(NSCLC)组织Beclin1、LC3表达变化，并分析二者表达与NSCLC患者临床病理特征的关系，旨在探讨细胞自噬在NSCLC发生、发展病中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2017年3月～2018年3月在承德市中心医院行外科手术治疗的NSCLC患者96例，术前均未行任何抗肿瘤治疗。其中，男62例、女34例，年龄48～75(61.4±8.34)岁；组织学类型：腺癌46例，鳞癌50例；组织分化程度：高分化38例，低中分化58例；有淋巴结转移40例，无淋巴结转移56例。对照标本取自NSCLC组织远端正常支气管及肺泡组织(距肿瘤边缘3～5 cm)，其中支气管组织60例份、肺泡组织64例份。本研究经承德市中心医院医学伦理委员会批准，患者或其家属知情同意。

1.2 Beclin1、LC3表达检测 采用免疫组化SP法。将组织标本用4%甲醛固定，经脱水、透明、浸蜡、包埋后，4 μm厚切片，烤干后保存。经环保透明剂脱蜡、梯度乙醇脱水后，加入柠檬酸缓冲液修复。正常山羊血清工作液封闭，然后加入一抗(Beclin1、LC3)，4 ℃孵育过夜。次日加入生物素化二抗工作液及辣根酶标记链霉卵白素工作液。DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片，显微镜下观察。用已知Beclin1、LC3阳性的组织切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。采用双盲法由两名资深病理科医师独立阅片，结果不一致时，由第三名病理科医师最终判定。每张切片随机选取10个高倍视野，每视野观察100个细胞，Beclin1、LC3阳性染色均定位于细胞质，呈棕黄色或褐色细颗粒状。根据阳性细胞所占比例及染色强度综合判定阳性表达。阳性细胞所占比例评分：≤5%为0分，﹥5%～25%为1分，﹥25%～50%为2分，>50%为3分；染色强度评分：无染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。两项得分相加≤3分为阴性表达，>3分为阳性表达。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计数资料以百分数表示，组间比较采用χ2检验。相关性分析采用Spearman相关分析法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组织Beclin1、LC3表达比较 Beclin1在NSCLC及正常肺泡、支气管组织中的阳性表达率分别为31.25%(30/96)、75.0%(48/64)、66.67%(40/60)。NSCLC组织Beclin1阳性表达率明显低于正常肺泡、支气管组织(χ2分别为29.418、18.723，P均<0.01)，而正常肺泡与支气管组织比较差异无统计学意义(χ2=1.044，P﹥0.05)。LC3在NSCLC及正常肺泡、支气管组织中的阳性表达率分别为26.04%(25/96)、81.25%(52/64)、80.0%(48/60)。NSCLC组织LC3阳性表达率明显低于正常肺泡、支气管组织(χ2分别为46.883、43.178，P均<0.01)，而正常肺泡与支气管组织比较差异无统计学意义(χ2=0.031，P﹥0.05)。

2.2 不同临床病理特征NSCLC患者肿瘤组织Beclin1、LC3阳性表达比较 肿瘤直径>3 cm、组织分化程度低中分化、有淋巴结转移者NSCLC组织Beclin1阳性表达率较肿瘤直径≤3 cm、组织分化程度高分化、无淋巴结转移者明显降低(P<0.05或<0.01)；组织分化程度低中分化、有淋巴结转移者NSCLC组织LC3阳性表达率较组织分化程度高分化、无淋巴结转移者明显降低(P均<0.01)。见表1。

表1 不同临床病理特征NSCLC患者癌组织Beclin1、LC3阳性表达比较

2.3 NSCLC组织Beclin1阳性表达与LC3阳性表达的关系 NSCLC组织Beclin1阳性表达与LC3阳性表达呈正相关关系(r=0.419，P<0.05)。

3 讨论

细胞自噬是细胞器和大分子物质在自噬体中降解的过程，通过降解细胞内衰老或因外界环境压力导致破损的细胞器、老化的蛋白质以及合成或折叠错误的蛋白质，从而实现细胞的自我修复和蛋白质的循环利用，加强细胞检查纠错作用，稳定细胞基因组，保持细胞自稳状态。自噬活性长期受到抑制，有害因素在细胞内持续积累，可导致肿瘤形成。人类绝大多数肿瘤中存在细胞自噬功能异常。恶性肿瘤组织营养需求旺盛，自噬可为肿瘤细胞提供营养，此时提高自噬活性有助于度过营养危机。放化疗后大量异常蛋白质及破损细胞器生成，自噬及时清除这些物质，可减轻有害物质对肿瘤细胞的损伤。研究显示，在乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌等细胞中存在自噬正向调节因子缺失[2～4]；细胞自噬被抑制后，在乳腺癌、结肠癌及睾丸癌等均观察到由环境压力导致的细胞凋亡增多。因此，细胞自噬在肿瘤发生、发展中具有双重作用，一方面细胞自噬能稳定细胞内环境使肿瘤细胞耐受缺氧环境，维持细胞存活；另一方面，当细胞自噬过度亢进，可诱导肿瘤细胞死亡，抑制肿瘤细胞增殖。

Beclin1基因是哺乳动物细胞中惟一特异性自噬基因，其编码蛋白与磷酯酰肌醇3激酶家族Ⅲ形成自噬体，介导其他自噬蛋白定位于吞噬泡，在自噬体的形成及成熟过程中发挥重要作用，是重要的抑癌基因。研究证实，Beclin1基因缺失及蛋白表达降低与肿瘤发生显著相关。小鼠细胞Beclin1的等位基因被敲除后，肺癌、肝癌、淋巴癌的发生率明显升高[5]，Beclin1+/-突变小鼠较野生型小鼠更易于诱发肿瘤。在人类肿瘤细胞中，Beclin1蛋白与PI3K形成复合体，可调节Atg蛋白在吞噬泡结构中的定位；其过表达能促进自噬小体成熟，诱导肿瘤细胞自噬活性增加[6]。有研究显示，卵巢癌、乳腺癌、乳腺导管癌及宫颈癌组织中Beclin1蛋白及mRNA表达明显降低[7～9]，原发性肝细胞癌组织Beclin1蛋白表达明显高于正常肝组织[10，11]，结直肠癌和胃癌组织中Beclin1过表达。目前认为，不同类型肿瘤组织中的表达差异可能与Beclin1对细胞自噬调控的双重性有关。消化系统肿瘤Beclin1高表达通过加强自噬活性，减轻肿瘤增殖过程中缺血、缺氧及有害物质对肿瘤细胞的杀伤作用，从而发挥肿瘤保护作用。本研究结果显示，Beclin1在NSCLC组织中的阳性表达率明显低于正常肺组织，提示在肺癌组织中Beclin1基因转录减少及其蛋白表达缺失，自噬活性明显降低，自噬体形成减少，肿瘤细胞自噬功能下降、凋亡不足，导致异常细胞持续增加，最终形成肿瘤。进一步分析显示，肿瘤直径>3 cm、组织分化程度低中分化、有淋巴结转移者NSCLC组织Beclin1阳性表达度较肿瘤直径≤3 cm、组织分化程度高分化、无淋巴结转移者明显降低，提示Beclin1在NSCLC早期表达活跃。其表达随肿瘤组织分化程度降低而逐渐下降，考虑为Beclin1基因低表达及蛋白缺失可使有缺陷的细胞凋亡减少，细胞生长呈现无节制、不受控状态。Beclin1表达越少，组织分化程度越低，肿瘤恶性倾向越明显。肿瘤晚期Beclin1完全失活，逐渐丧失其抑癌功能，更具侵袭性和转移能力，故患者预后较差。

LC3是惟一定位于自噬泡内膜的自噬调节蛋白。当细胞自噬启动后，LC3前体首先加工成LC3-Ⅰ并溶于细胞质内，与自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)结合生成LC3-Ⅱ。只有与PE结合状态的的LC3-Ⅱ定位于自噬泡膜上，才能发挥调节功能，故LC3-Ⅱ蛋白表达与自噬泡数量呈正相关关系，可直接反映细胞自噬活性[12]。胃癌、结直肠癌及宫颈癌等组织中LC3异常表达[13]。Wu等[14]报道，LC3在中低分化结直肠癌组织中的表达明显低于高分化结直肠癌组织，在伴淋巴结转移的结直肠癌组织中的表达高于无淋巴结转移的结直肠癌组织。本研究结果显示，NSCLC组织LC3阳性表达率明显低于正常组织，组织分化程度低中分化、有淋巴结转移者NSCLC组织LC3阳性表达率较组织分化程度高分化、无淋巴结转移者明显降低。提示在NSCLC中细胞自噬活性下调，随着组织分化程度下降及淋巴结转移，其表达逐渐降低，推测LC3低表达可能与NSCLC发生、发展有关。在NSCLC发生、发展过程中，LC3表达下调使自噬体生成减少，自噬活性降低，增加了肿瘤易感性，促进了肿瘤进展。

本研究发现，NSCLC组织Beclin1阳性表达与LC3阳性表达呈正相关关系。推测两者作为细胞自噬调节通路的上下游靶点，具有协同促癌作用；其同步低表达可导致细胞自噬能力降低、内环境自稳能力障碍，可导致NSCLC的发生、发展。NSCLC形成以后，Beclin1作为抑癌基因激活细胞自噬，LC3加快自噬小体成熟速度，二者共同促进细胞自噬活性增加，导致肿瘤细胞程序性死亡，从而产生抑癌作用；肿瘤细胞增殖失控导致其长期处于缺血、缺氧状态，细胞内有毒有害物质大量堆积，刺激肿瘤细胞的自噬活性持续升高，最终导致肿瘤细胞发生自噬性死亡。

综上所述，NSCLC组织自噬相关蛋白Beclin1、LC3表达降低，细胞自噬对NSCLC的发生、发展可能具有抑制作用。