食管鳞癌组织中ABCG2、p16表达变化及意义

陈晓依，吕洋，刘博，李秀娟，刘军超，常楚迪

(1河北北方学院，河北张家口075000；2河北北方学院附属第一医院)

食管癌是临床常见的消化系统恶性肿瘤。研究显示，我国食管癌发病率占全部恶性肿瘤的第5位，病死率占第4位，其最常见的组织学类型为鳞状细胞癌(ESCC)[1]。目前外科手术仍为其治疗的首选方法，但早期食管癌患者术后5年总生存率仅30%；手术治疗效果差的原因主要为局部复发、远处转移，而且术后患者机体免疫力低下[2]。ABC跨膜转运体家族是人类最大的转运蛋白基因家族，其中三磷酸腺苷结合盒转运体蛋白2(ABCG2)是ABC家族转运蛋白G族第2个成员，在多种肿瘤组织中呈高表达[3]。p16基因是近年来发现的继p53基因之后的又一抑癌基因，又称为多肿瘤抑制基因,属于cyclin-CDK复合物的特异性抑制剂，且为细胞周期调控的分子开关[4]。本研究主要观察ABCG2、p16在ESCC组织中的表达变化，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2008年1月～2009年12月河北北方学院附属第一医院行手术治疗的原发性ESCC患者136例，均经病理检查确诊，男91例、女45例，年龄27～80岁、中位年龄61岁，术前均未接受过治疗。术中留取ESCC组织。另取性别、年龄相匹配ESCC患者的正常食管黏膜组织(距癌组织>5 cm)37例份作对照。本研究患者均知情同意，且经医院伦理委员会批准。

1.2 ESCC组织及正常食管黏膜组织中ABCG2、P16蛋白表达检测 采用免疫组化SP染色法，严格按试剂盒说明书操作。取石蜡切片，经柠檬酸缓冲液(pH 6.0)高压抗原热修复，阴性对照用PBS代替。结果判定：ABCG2蛋白主要定位于细胞膜，p16蛋白主要定位于细胞核，以呈现棕黄色颗粒为细胞染色阳性。高倍镜下，每样本随机选取5个视野，计算阳性细胞百分比。阳性细胞百分比<25%计1分，25%～50%计2分，≥50%计3分；着色强度为无色计0分，灰黄色计1分，金黄色计2分，棕黄色计3分。将以上两项评分相加，<3分为表达阴性，≥3分为表达阳性[5]。以上均至少由两名病理医师在双盲条件下观察。

1.3 ESCC组织及正常食管黏膜组织中ABCG2、p16 mRNA表达检测 采用qRT-PCR法。将组织置于液氮中充分研磨，用TRIzol法提取组织细胞总RNA，参照TaKaRa试剂盒说明书进行反转录和目的基因ABCG2和p16(大连宝生物公司)的扩增，以GAPDH(大连宝生物公司)为内参。ABCG2引物(280 bp)：上游5′-GGTCAGAGTGTGGTTTCTGTAGCA-3′、下游5′-GTGAGAGATCGATGCCCTGCTTTA-3′；p16引物(522 bp)：上游5′-TGGCTCTGACCATTCTGT-3′、下游5′-AGCTTTGGAAGCTCTCAG-3′；GAPDH引物(452 bp)：上游5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′、下游5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。扩增反应体系试剂盒(大连宝生物公司)20.0 μL：SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ 10.0 μL，Rox Reference Dye 0.4 μL，sense primer(10 pmol/μL)0.8 μL，antisense primer(10 pmol/μL)0.8 μL，dH2O 7.0 μL，cDNA模板1 μL。扩增条件：预变性95 ℃、30 s，1个循环。PCR反应：95 ℃、10 s，60 ℃、32 s，40个循环。用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

2 结果

2.1 ESCC组织及正常食管黏膜组织中ABCG2、p16蛋白阳性表达率比较 ESCC组织及正常食管黏膜组织中ABCG2蛋白阳性表达率分别为62.5%(85/136)、24.3%(9/37)，p16蛋白阳性表达率分别为32.4%(44/136)、56.8%(21/37)。与正常食管黏膜组织比较，ESCC组织中ABCG2蛋白阳性表达率高(P<0.05)、p16蛋白阳性表达率低(P<0.05)。

2.2 ESCC组织及正常食管黏膜组织中ABCG2、p16 mRNA表达比较 ESCC组织及正常食管黏膜组织中ABCG2 mRNA相对表达量分别为0.76±0.06、0.58±0.04，p16 mRNA相对表达量分别为0.39±0.03、0.62±0.05。与正常食管黏膜组织比较，ESCC组织中ABCG2 mRNA相对表达量高(P<0.05)、p16 mRNA相对表达量低(P<0.05)。

2.3 ABCG2及p16蛋白阳性表达与患者临床病理参数的关系 ABCG2及p16蛋白阳性表达与肿瘤浸润深度、TNM分期及淋巴结转移有关(P均<0.05)，与患者性别、年龄及肿瘤组织学分级无关(P均>0.05)。见表1。

2.4 ESCC组织中ABCG2与p16蛋白表达的相关性 ABCG2与p16蛋白在ESCC组织中的表达呈负相关(r=-0.438，P<0.05)。

表1 ABCG2及p16蛋白阳性表达与患者临床病理参数的关系(例)

3 讨论

近年来，随着化疗药物及方案的改进，食管癌的化学治疗取得了很大的进步，但耐药仍是肿瘤化疗的主要难题之一，其对化疗效果和患者预后有较大影响。多重耐药的形成与多药耐药基因、蛋白的高表达有密切联系[6]。ABCG2又称乳腺癌耐药蛋白，是近年来发现的ABC超家族成员之一，定位在人体染色体4q22中，具有1个ATP结合位点和1个跨膜区[7]。其主要通过参与泵出细胞内的化疗药物，降低胞内药物含量，引起耐药[8]。本研究检测发现，ABCG2在ESCC组织中的阳性表达率高于正常食管黏膜组织。进一步研究发现，ABCG2蛋白阳性表达与ESCC患者性别、年龄及组织学分级无关，与肿瘤的浸润深度、TNM分期及淋巴结转移有关，肿瘤侵至全层、TNM分期高、有淋巴结转移的患者ABCG2的阳性率高。同时发现，ESCC组织中ABCG2 mRNA的相对表达量高于正常食管黏膜组织，进一步提示ABCG2高表达可能与ESCC的发生发展相关。

p16是近年来发现的抑癌基因，由148个氨基酸构成，位于9号染色体短臂21～22区(9p21～22)，编码产物为含有4个独特的锚蛋白重复结构。p16在肿瘤发展过程中发生突变、缺失及甲基化导致失活，最终引起肿瘤的发生[9]。Mathew等[10]研究显示，p16的缺失与ESCC病理分期及远处器官转移相关。本研究发现，p16蛋白在ESCC组织中的阳性表达率低于食管正常黏膜组织。这说明与恶性黑色素瘤、尿路上皮癌、神经胶质瘤、前列腺腺癌和透明细胞性肾细胞癌等恶性肿瘤类似，p16在ESCC组织中的表达低于其在正常黏膜组织中的表达[11]。另外，肿瘤侵至全层、TNM分期高、有淋巴结转移的患者p16的阳性率低，这与赵醒等[12]的研究结果一致。同时发现，ESCC组织中p16 mRNA的相对表达量低于正常食管黏膜组织，以上结果均说明p16基因的低表达可能与ESCC的恶性程度有关。相关分析显示，ABCG2与p16在ESCC组织中的表达呈负相关，说明二者在ESCC的发生发展过程中可能协同作用，共同影响肿瘤的进展。

综上所述，ABCG2和p16在ESCC组织中的异常表达可能与肿瘤的发生发展相关，研究两者的表达情况有助于ESCC的辅助诊断及指导治疗。

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