甘草酸对缺血/再灌注大鼠心肌细胞凋亡的影响及机制探讨

余鑫鑫，陈阳

(武汉大学人民医院，武汉430060)

甘草酸提取于植物甘草根茎部位，其分子结构中含有葡萄糖醛酸和甘草次酸，并且水溶性较好[1]。细胞和动物实验研究结果发现，甘草酸在抗炎症、调节氧化还原平衡、参与机体免疫调节、抗病毒感染、抑制肿瘤细胞增殖、保肝护肝等方面有显著作用[2]。Lin等[3]研究发现，甘草酸分子中含有五环三萜结构，与糖皮质激素具有相似的药理活性，在治疗炎症和抑制细胞凋亡方面作用较为显著，因此在急慢性肝炎、支气管炎及艾滋病等治疗中备受青睐。细胞凋亡在心血管疾病发病机制中起关键的诱导作用，因此在心血管疾病治疗中对心肌上层表皮细胞凋亡进行抑制可以很好地改善疾病。细胞凋亡受多个信号通路程序性调控，将信号通路中的蛋白作为药物治疗靶点，可对相关通路进行抑制，进一步抑制细胞凋亡的发生，改善心脏功能[4]。2016年2～4月，本研究观察了甘草酸对缺血/再灌注大鼠心肌细胞凋亡的影响，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂及仪器 健康成年雌性SD大鼠50只，体质量230～260 g，由巴菲尔生物技术有限公司提供。甘草酸(Sigma公司，≥99%)；细胞凋亡原位检测试剂盒(Roche公司)；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(巴菲尔生物技术有限公司)；兔抗鼠丝分裂原活化蛋白激酶4/7(MKK4/7)、c-Jun氨基末端激酶1/2/3(JNK1/2/3)、磷酸化MKK4/7(p-MKK4/7)、磷酸化JNK1/2/3(p-JNK1/2/3)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)8、B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)蛋白、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、Caspase-3单克隆抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司，二抗羊抗兔IgG购自美国LI-COR Biosciences公司；电热恒温干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；轮转式石蜡切片机(浙江金华益迪医疗设备厂)。

1.2 动物分组、造模及用药处理 将大鼠随机分为假手术组、模型组及甘草酸低、中、高剂量组5组，各10只。后四组制备缺血/再灌注大鼠模型，构建方法借鉴Zhang等[5]方法。具体方法如下：大鼠术前禁食24 h，正常饮水。称重后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，切开大鼠颈部，分离左侧颈动脉，行颈动脉置管。开胸并打开心包，使心脏充分暴露，在左心耳下1～2 cm处用真丝线穿过心脏表层，结扎左冠状动脉降支，引起心肌缺血，半小时后松开结扎，使缺血冠状动脉再灌注24 h。关闭胸腔，缝合后注射青霉素防止感染。缺血大鼠模型构建的评价标准是左心室前壁紫绀及同步心电图Ⅱ导联ST段增高，再灌注模型构建评价标准是紫绀逐渐红润及ST段降低1/2，同时满足上述两种情况标志着构建的缺血/再灌注大鼠模型成功。假手术组与模型组手术前处理相同，但只穿线不结扎左冠状动脉降支。甘草酸低、中、高剂量组在缺血前半小时分别股静脉注射30、60、90 mg/kg的甘草酸，假手术组与模型组注射同体积生理盐水。在灌注结束后，低温条件下迅速剪下各组大鼠心脏，根据后续实验对组织进行不同的处理。

1.3 心肌细胞凋亡率测算 采用TUNEL法。将各组心肌组织放入二甲苯中脱蜡5～10 min，再次更换新鲜二甲苯继续脱蜡5～10 min后，加入无水乙醇洗去二甲苯，滴加不含DNase的蛋白酶K，20～30 ℃作用半小时后，PBS洗涤3次，加入含0.1%的Tgiton X-100的PBS，冰浴2 min，然后置于荧光显微镜下观察。根据阳性凋亡心肌细胞的分布情况，每个标本捕获10个视野，记录每个视野40个细胞中的凋亡细胞数，计算各组心肌细胞凋亡率。

1.4 心肌组织中MKK/JNK信号通路及凋亡蛋白检测 采用Western blotting法。取各组大鼠心肌组织，剪碎放入RIPA裂解液中进行碾磨提取蛋白。利用BCA试剂盒操作说明检测所提取蛋白浓度，计算上样体积。向蛋白液中加入1/4体积的蛋白上样缓冲液，充分混匀后于100 ℃变性10 min。每孔加样量蛋白为25 μg，根据所检测目的蛋白分子量配制10%的SDS-琼脂糖凝胶。电泳过程中，浓缩胶电泳时电压控制在70 V，分离胶电泳时电压控制为120 V；待电泳完成后，在275 mA条件下转膜60 min；完成后将膜浸泡于5%脱脂奶粉中封闭1 h，洗膜，将条带放入MKK4/7、p-MKK4/7、JNK1/2/3、p-JNK1/2/3、Caspase-8、Bcl-2、Bax、Caspase-3一抗中4 ℃孵育过夜；再常温下孵育HPR标记的羊抗兔二抗1 h，TBST洗膜3次。用Odyssey双色红外激光成像系统扫膜分析蛋白表达水平。

1.5 心肌组织病理学观察 收集各组大鼠心肌组织，经甲醛固定、石蜡包埋、制成切片后，先用苏木精液染色5 min，经过多次洗涤后，再用0.5%伊红液染色3 min，洗涤后用中性树胶封固，光镜下观察心肌组织病理改变。

2 结果

2.1 各组心肌细胞凋亡率比较 假手术组、模型组、甘草酸低剂量组、甘草酸中剂量组、甘草酸高剂量组细胞凋亡率分别为2.34%±0.62%、28.53%±1.95%、23.27%±1.58%、16.27%±1.49%、8.92%±1.87%，假手术组与模型组相比，后四组两两相比，P均<0.05。

2.2 各组心肌组织中MKK/JNK信号通路蛋白表达比较 结果见表1。

表1 各组心肌组织中MKK/JNK信号通路蛋白表达比较

注：与假手术组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05；与甘草酸低剂量组相比，cP<0.05；与甘草酸中剂量组相比，dP<0.05。

2.3 各组心肌组织中凋亡蛋白表达比较 结果见表2。

表2 各组心肌组织中凋亡蛋白表达比较

注：与假手术组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05；与甘草酸低剂量组相比，cP<0.05；与甘草酸中剂量组相比，dP<0.05。

2.4 各组心肌组织病理学观察结果 假手术组大鼠心肌纤维正常、细胞排列分布均匀、细胞饱满、细胞结构清晰可见，细胞中未发现水肿、变性坏死及炎性细胞浸润。模型组大鼠心肌细胞排列杂乱无章，出现较多变性坏死细胞，细胞水肿，胞核明显皱缩，还出现较多炎性细胞浸润。甘草酸低、中剂量组心肌纤维细胞排列杂乱无章，心肌细胞部分出现水肿、空泡，偶尔可见点状坏死，细胞水肿及炎性细胞较少。甘草酸高剂量组大鼠心肌细胞排列规则整齐，细胞分布均匀，心肌纤维完整性较好，存在轻度间质水肿，还可见少许炎性细胞浸润。

3 讨论

甘草酸具有广泛的药理活性，在临床上的应用也较为广泛。基础研究发现，甘草酸可以抑制艾滋病病毒增殖，诱导多种肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，还介导机体免疫调节等。与此同时，学者对甘草酸药理作用的相关研究越来越多，对其药理活性及作用机制也不断深入，促使甘草酸的应用领域不断扩大。于是，本文研究了甘草酸对缺血/再灌注大鼠心肌细胞凋亡的影响，并对其作用机制进行了初步研究。

本研究结果发现，与假手术组相比，模型组细胞凋亡率高、Caspase-8表达高、Bax表达高、Caspase-3表达高、Bcl-2表达低，与模型组相比，甘草酸中剂量组及甘草酸高剂量组细胞凋亡率低、Caspase-8表达低、Bax表达低、Caspase-3表达低、Bcl-2表达高。缺血/再灌注会引起心肌细胞凋亡的发生，可能是由于缺血/再灌注引发的缺血缺氧导致心肌组织氧化应激损伤，氧自由基的过度累积会激活炎性因子的释放；多种炎症因子会通过作用膜上相关受体，促使NF-κB向细胞核内的转移，诱导多种促凋亡基因(Caspase-8、Bax、Caspase-3)的表达[6,7]。促凋亡蛋白Bax与抗凋亡蛋白Bcl-2比例发生失衡，导致细胞凋亡的发生[8]。甘草酸可以抑制心肌细胞因缺血/再灌注所引起的凋亡，对心肌细胞起到一定的保护作用。同样本研究采用HE染色法发现甘草酸剂量依赖性地减轻心肌组织损伤的病理形态学变化。

为了进一步研究甘草酸通过何种信号通路来抑制心肌细胞的凋亡，我们采用了免疫印迹方法检测了细胞内凋亡相关蛋白的表达。缺血/再灌注会引起氧化应激损伤，进一步导致炎性因子分泌增加。早期也有研究报道，JNK通路可被多种细胞因子(如TNF-α、IL-6、EGF等)、应激(如紫外线、电离辐射、氧化应激等)以及某些G蛋白偶联受体激活，参与机体组织细胞的凋亡与坏死[9]。程军等[10]认为，JNK信号通路参与细胞凋亡，在缺血/再灌注损伤的病理变化过程中起重要作用，与缺血/再灌注损伤存在高度的相关性。同样，本研究发现模型组p-MKK4/7、p-JNK1/2/3表达水平高于假手术组。缺血/再灌注大鼠MKK4/7/JNK1/2/3信号通路处于高度活化的状态，进而诱导了凋亡相关蛋白水平的改变，导致心肌细胞凋亡的发生。与模型组相比，甘草酸中剂量组及甘草酸高剂量组p-MKK4/7、p-JNK1/2/3表达低。由此可见，甘草酸可抑制MKK4/7和JNK1/2/3蛋白的磷酸化水平，进而减少心肌细胞凋亡的发生。

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