肺鳞癌患者血清25羟维生素D水平及其与氧化应激、DNA损伤的关系

谢雅丽，李国平

(1西南医科大学附属医院，四川泸州 646000；2成都市第三人民医院)

肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其病死率居恶性肿瘤首位。研究[1]发现，氧化应激与DNA损伤可能参与了肺癌的发生发展。近年来有研究[2]发现，25羟维生素D有减轻哮喘患者体内氧化应激的作用,并且与慢性阻塞性肺疾病、肺部感染等多种呼吸系统疾病相关,且25羟维生素D对甲状腺乳头状癌、肝癌、宫颈癌等肿瘤也有明显的保护作用，但目前在肺鳞癌中研究较少。本研究观察了肺鳞癌患者血清25羟维生素D水平，并探讨其与氧化应激、DNA损伤的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016年4月～2017年4月于西南医科大学附属医院呼吸内科就诊的肺鳞癌患者60例作为实验组，其中男31例、女29例，年龄(50±5)岁，每天吸烟≥20支，持续时间均在20年以上。所有患者通过胸部CT及病理学证实为肺鳞癌，TNM分期均为Ⅳ期，就诊前均未进行过任何治疗，并排除近期感染及其他疾病因素。选取同期健康体检者30例作为对照组，其中男16例、女14例，年龄(51±4.5)岁。两组性别、年龄相比差异均无统计学意义。两组近期均未服用过维生素D相关制剂。本研究经我院医学伦理学委员会批准，所有患者知情同意。

1.2 血清25羟维生素D检测 在清晨空腹状态下采集两组静脉血3 mL。所有标本均在采集后室温放置30 mim，2 500 r/min离心15 min。收集上清液，采用ELISA法测定两组血清25羟维生素D水平，操作步骤严格按试剂盒说明书进行。

1.3 氧化应激指标检测

1.3.1 细胞内氧化应激指标H2O2、超氧阴离子检测 用肝素抗凝管采集两组静脉血4 mL，采用密度梯度离心法提取外周血单个核细胞(PBMC)，显微镜下细胞计数，至少达1×106/mL。采用2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)、二氢乙啶(DHE)探针测定细胞内活性氧，DCFH-DA探针检测细胞内H2O2，DHE探针检测细胞内超氧阴离子。检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所，避光状态下严格按照试剂盒说明书进行操作。最后上流式细胞仪检测，测定各个样本细胞内DCF及DHE的平均荧光强度，每个样本至少分析1×105个PBMC。数据使用FlowJo Software分析。

1.3.2 血清氧化应激指标超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量检测 在清晨空腹状态下，采集两组静脉血3 mL。所有标本在采集后室温放置30 mim，2 500 r/min离心15 min，用移液器吸取分离的血清至EP管中，保存至-80 ℃冰箱，待标本收齐后统一测定。采用黄嘌呤氧化酶法及硫代巴比妥酸法(TBA法)分别检测血清SOD活力及MDA含量，SOD及MDA试剂盒均购自南方建成生物公司，严格按试剂盒说明书进行操作。

1.4 DNA损伤指标γ-H2AX检测 兔γ-H2AX(Ser139)单克隆抗体购自美国Abcam公司。用肝素抗凝管采集两组静脉血4 mL，采用密度梯度离心法提取PBMC，显微镜下细胞计数，至少达1×106/mL。用2%多聚甲醛1 mL室温下固定60 min，PBS洗涤，0.2% Triton X-100 1 mL透膜15 min，PBS洗涤，1% BSA(胎牛血清)37 ℃下封闭30 min，PBS洗涤，室温下一抗(γ-H2AX)孵育30 min，PBS洗涤，室温下二抗(FITC-羊抗兔IgG，武汉博士德生物工程有限公司)避光孵育30 min，PBS洗涤，最后制成400 μL的PBS悬液，上流式细胞仪检测。测定样本细胞内γ-H2AX水平(DNA损伤率)及γ-H2AX平均荧光强度，每个样本至少分析1×105个PBMC。数据使用FlowJo Software分析。

2 结果

2.1 两组血清25羟维生素D水平比较 实验组、对照组血清25羟维生素D水平分别为(19.42±6.45)、(56.08±15.16)ng/mL，两组相比P<0.05。

2.2 两组氧化应激指标比较 结果见表1。

表1 两组氧化应激指标比较

注：与对照组相比，*P<0.05。

2.3 两组DNA损伤指标比较 实验组、对照组γ-H2AX水平分别为37.91%±16.55%、3.51%±1.16%，平均荧光强度分别为8.74±1.98、3.63±0.60，两组相比P均<0.05。

2.4 实验组血清25羟维生素D与氧化应激及DNA损伤指标的相关性 实验组血清25羟维生素D水平与H2O2、超氧阴离子、MDA含量、γ-H2AX水平、γ-H2AX平均荧光强度均呈负相关(r分别为-0.78、-0.72、-0.46、-0.66、-0.64，P均<0.05)，与SOD活力呈正相关(r=0.62，P<0.05)。

3 讨论

25羟维生素D由维生素D转换而来，在人体内具有重要的生物活性。有研究[3,4]指出，25羟维生素D不仅可调节体内钙磷代谢，还对自身免疫、神经系统及内分泌系统等具有调节作用。Graziano等[5]研究发现，25羟维生素D能保护细胞免受氧化应激损伤，是清除细胞内过氧化物的抗氧化剂，可以诱导细胞分化、抑制细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡、稳定细胞染色体结构，从而防止细胞DNA链的断裂和解聚。本研究发现，实验组血清25羟维生素D水平低于对照组，表明低水平的血清25羟维生素D可能在肺鳞癌的发生发展中起一定作用。既往研究也证实了相似的结果。Grant[6]对美国人群的研究提示，太阳紫外线辐射(增加维生素D)和肺癌病死率呈负相关。Mohr等[7]研究了多个国家的肺癌发生率，发现紫外线照射量与肺癌的发生率有关。肿瘤与25羟维生素D存在相互作用，一方面25羟维生素D的缺乏会导致肿瘤的发生，另一方面肿瘤疾病会导致患者户外活动减少，日照时间短，使25羟维生素D合成减少[8]。这些研究均表明，25羟维生素D可能与肺鳞癌存在密切关系，25羟维生素D的缺乏可能会在一定程度上导致肺鳞癌的发生发展。

本研究发现，实验组氧化应激指标PBMC的H2O2、超氧阴离子及血清MDA含量高于对照组，血清SOD活力低于对照组，说明实验组的氧化应激水平高于对照组。本研究还发现，实验组血清25羟维生素D水平与H2O2、超氧阴离子、MDA含量均呈负相关，与SOD活力呈正相关。这表明随着肺鳞癌患者血清25羟维生素D水平的降低，其氧化应激水平明显增强。氧化应激为中性粒细胞启动免疫防御反应后的一种机制，其可通过多种途径参与肿瘤的发生、发展。Deng等[9]曾指出，维生素D作为一种抗氧化剂，可保护细胞蛋白质和细胞膜免受氧化损伤，并且能减少细胞的氧化应激反应，增加其抗氧化能力。既往在哮喘相关的研究[2]中发现，25羟维生素D的缺乏会引起血清氧化型二氯荧光素(DCF)、二氢乙啶(DHE)等指标的增加，导致哮喘患者体内氧化应激的增强。25羟维生素D缺乏引起的氧化应激指标的增加，可能是导致肺鳞癌患者体内高氧化应激状态的原因所在。

γ-H2AX被认为是一种早期检测DNA损伤最有效的生物学标志物。本研究结果发现，实验组PBMC的γ-H2AX水平、平均荧光强度高于对照组。表明实验组的DNA损伤程度高于对照组。本研究结果还发现，实验组血清25羟维生素D水平与γ-H2AX水平、平均荧光强度均呈负相关。研究结果表明，随着肺鳞癌患者血清25羟维生素D水平的降低，其DNA损伤程度随之增高。这可能是由于肺鳞癌患者体内低水平的25羟维生素D会降低细胞抗氧化的能力，导致DNA的氧化损伤。有研究[1]发现，活性氧的产生和细胞抗氧化能力之间严重失衡引起的氧化应激会导致各种类型生物大分子的损失，例如DNA、RNA、脂类、蛋白质等，活性氧对这些生物大分子的损伤最终将导致细胞的凋亡。若氧化应激作用于支气管上皮细胞，使癌基因(如Ras基因)激活和抑癌基因(如p53、FHIT基因)失活，便会引起细胞的转化、DNA的损伤，导致肺鳞癌的发生。目前，25羟维生素D减轻肺鳞癌的氧化应激及DNA损伤的机制尚不明确。但有研究[10]指出，25羟维生素D可以调节硫氧还原蛋白结合蛋白(TXNIP)的表达，而TXNIP是调节机体氧化应激的重要物质[11]。25羟维生素D缺乏会引起TXNIP增高，TXNIP增高一方面会抑制硫氧还原蛋白的抗氧化能力，造成活性氧的堆积及氧化应激损伤，另一方面会激活凋亡信号调节激酶1(ASK-1)相关的凋亡通路，最终导致细胞凋亡[12]，引起DNA的损伤。

因此，我们推测25羟维生素D可能与肺鳞癌的氧化应激及DNA损伤密不可分，充足的25羟维生素D可能有减轻肺鳞癌氧化应激及DNA损伤的作用，起到对肺鳞癌患者的保护作用，可预防肺鳞癌的发生发展。

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