胸水、血液EGFR基因突变检测在非小细胞肺癌治疗中的应用价值

黄健，王于理，代平，孟娟娟，李晶，马晓平，巩平

(石河子大学医学院第一附属医院，新疆石河子832000)

非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌的80%～85%，是我国最常见的恶性肿瘤之一[1]，发现时多数患者已是晚期，失去手术机会，且放化疗效果难尽人意。随着肿瘤学的飞速发展，分子靶向治疗备受关注，其中表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)对EGFR基因突变阳性的NSCLC患者有着显著的疗效。经EGFR-TKI治疗后，EGFR基因有二次突变产生获得性耐药的情况，其中T790M突变较多见[2,3]，因此EGFR基因突变状态的检测显得尤为重要。然而，临床上组织样本取材困难，二次取材活检更是无法实现。外周血及胸水是一种存在于实性肿瘤组织外，可用于EGFR基因检测的肿瘤成分[4～6]。本研究分析了NSCLC患者胸水及血液中EGFR基因突变检测结果，为指导NSCLC的靶向治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源 选取2016年2月～2017年6月石河子大学医学院第一附属医院初诊的40例NSCLC患者的胸水及血液标本，所有患者经组织病理证实明确EGFR基因是否突变并伴恶性胸水，其中EGFR基因突变阳性26例、阴性14例。同时收集21例经EGFR-TKI靶向治疗耐药后的患者胸水及血液标本。本研究经医学伦理委员会批准，所有患者知情同意。

1.2 胸水及血液中EGFR基因检测 取胸水样本30 mL，3 000 r/min，室温离心10 min，收集细胞沉淀，如沉淀量不够可反复离心收集，将样本于-80 ℃保存备用。按QIAamp DNA FFPE Tissue Kit试剂盒说明书，提取胸水细胞DNA。采集患者前臂静脉血6 mL，置于1.5 mL离心管内，3 000 r/min离心10 min取上清液，于-80℃保存备用。按QIAam Blood Mini Kit试剂盒说明书提取血清游离DNA。利用紫外线分光光度计检测各样本DNA的浓度和纯度，确保A260/280值为1.8～2.0。将样本的DNA按照人类ADx-EGFR基因突变检测试剂盒说明书对所有标本进行21种已知突变的检测。待测样本DNA浓度调整为1～3 ng/μL。用ABI7500实时荧光PCR仪进行检测。按照试剂盒说明书提供的判读原则，确定标本EGFR基因突变状态。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件进行分析，采用χ2检验分别比较胸水、外周血标本与组织标本EGFR基因突变率的差异，胸水与外周血标本EGFR基因突变率的差异。P<0.05为差异有统计学意义。Kappa>0.75为一致性好，0.4≤Kappa≤0.75为一致性良好，Kappa小于0.4为一致性差。

2 结果

NSCLC患者胸水中EGFR基因突变23例(57.5%)，与组织中EGFR基因检测结果比较见表1。血液中EGFR基因突变阳性13例(32.5%)，与组织中EGFR基因检测结果比较见表2。胸水与血液中EGFR基因检测结果比较见表3。胸水标本检测NSCLC患者EGFR基因突变的灵敏度为88.46%，特异度为100%，约登指数为0.885；血液标本检测NSCLC患者EGFR基因突变的灵敏度为50.00%，特异度为100%，约登指数为0.500。

表1 胸水与组织中EGFR基因检测结果比较(例)

表2 血液与组织中EGFR基因检测结果比较(例)

表3 胸水与血液中EGFR基因检测结果比较(例)

在21例EGFR-TKI治疗耐药患者的胸水和血液样本中，胸水中检出14例T790M基因突变，突变率为66.7%(14/21)；其中2例由19外显子缺失变成野生型，1例由L858R变成野生型，4例未检出EGFR基因二次突变。血液中检出11例T790M突变，突变率为52.4%(11/21)；有4例胸水检出T790M二次突变而血液检测为阴性，另外1例血液检出T790M二次突变而胸水未检出二次突变，其他结果与胸水一致。

3 讨论

EGFR基因位于第7号染色体短臂上，包含28个外显子，大小约170 kD。有研究[7～9]表明，EGFR-TKI可明显提高EGFR基因突变阳性NSCLC患者的无疾病进展生存期及总生存期，其中19外显子缺失突变及21外显子L858R点突变明显提高了与抑制剂的结合能力，因此检测EGFR基因突变状态是EGFR-TKI靶向治疗的关键所在。对于晚期NSCLC无法获取组织活检的患者而言，急需寻求新的替代样本进行基因检测。大量研究表明，组织DNA和循环DNA一致性较好，胸水是晚期肺癌常见并发症，含有正常细胞和肿瘤细胞，取样方便、创伤小。美国胸科医师学会循证临床实践指南[10]指出，胸水细胞学诊断敏感性平均为63%。Liu等[11]研究发现，胸水细胞块与组织样本的一致率为81%。外周血循环DNA是肿瘤细胞凋亡和坏死后游离于血浆中的DNA片段，其含量和基因状态与肿瘤进展相关。我们课题组前期实验[4]结果发现，血清与组织EGFR基因突变状态的检测一致性良好。因此，胸水和外周血均有可能成为基因检测的新途径。本课题结果显示，胸水测EGFR基因突变状态与组织对比一致率为92.50%(Kappa=0.843)，一致性极好；而血液测EGFR基因突变状态与组织对比一致率良好，为67.50%(Kappa=0.412)。因此，我们认为对无法获取组织活检的NSCLC患者，胸水及血液可替代组织成为新的EGFR基因检测途径。

另外，血液与胸水检测结果共同阳性13例，共同阴性17例，胸水阳性而血液阴性有10例，两种标本相对比，血液标本检测结果一致率明显低于胸水标本，差异有统计学意义，其灵敏度和约登指数也较低。导致这种差异的原因，可能与血液中ctDNA片段较短、浓度较低、肿瘤分期以及标本处理技术等多种因素有关。由此表明，胸水检测EGFR明显优于血液标本;在晚期肺癌患者中，若伴有恶性胸水时，优先选择胸水检测EGFR基因突变状态。血液标本同时检测可增加EGFR基因的检出率，但仍需进一步研究和探索胸水和血液检测EGFR基因状态的关键技术，以提高其检测的灵敏度和检出率，这对在临床开展和实施对肺癌患者的早期筛查、诊疗以及EGFT-TKI治疗后随访具有重要的临床意义。

研究表明，多数EGFR基因突变阳性的晚期NSCLC患者在使用EGFR-TKI治疗9～13个月后会出现获得性耐药。Honda等[12]发现，EGFR基因状态在靶向治疗过程中发生改变的情况可能是获得性耐药机制之一。有研究[13,14]对EGFR基因敏感突变患者经EGFR-TKI治疗耐药后的二次活检分析发现，T790M基因突变率较高，初步表明T790M基因突变是EGFR-TKI获得性耐药的重要机制之一。随着分子靶向治疗的不断发展，有Ⅱ期临床试验[15]证实，相对于其他耐药机制而言，目前针对T790M突变阳性患者研发的第三代EGFR-TKI药物具有较好的客观缓解率、安全性和延长进展后生存期。因此，尽早发现EGFR-TKI治疗后的患者是否出现EGFR基因二次突变情况，成为目前靶向治疗的一个新热点。本研究通过ADx-ARMS法检测21例EGFR-TKIs治疗耐药患者的胸水和血液样本，胸水中检出14例T790M基因突变，血液中检出11例T790M突变;有4例胸水检出T790M二次突变而血液检测为阴性，另外1例血液检出T790M二次突变而胸水未检出二次突变，两种样本的其他检测结果一致。血液检出T790M突变而胸水未检出的情况，可能与肿瘤异质性相关。由于肿瘤的异质性广泛存在，瘤内不同癌细胞亚群、原发灶与转移灶间均存在一定差异，均可导致EGFR基因检测结果出现偏差。

可见，利用胸水及血液标本具有微创、方便快捷的特点，多次、多时段、多种样本动态监测EGFR基因突变状态，降低肿瘤异质性以及检测技术造成的假阳性和偏差，同时可以及时检测出EGFR基因是否发生耐药突变。相对于影像学及肿瘤标记物评估结果而言，该法能更早地预测和评估治疗后耐药情况，从而个性化指导治疗耐药后晚期NSCLC患者的靶向治疗。

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