新疆哈萨克族食管鳞癌组织中长链非编码RNA MIR663AHG的表达及其相关mRNA

程丽云，史贵军，方春晓，李光华，郑勇，陈卫刚

(石河子大学医学院第一附属医院，新疆石河子 832000)

食管癌是起源于食管上皮的恶性肿瘤，是常见的消化道恶性肿瘤之一，在世界范围内具有较高的发病率和病死率[1]。我国是世界上食管癌发病率较高的国家之一，病理类型以鳞癌为主，其中位于新疆北部的哈萨克族是我国食管鳞癌发病率最高的民族。1990年的全国死因回顾调查资料显示，新疆哈萨克族食管癌的标化病死率为68.95/10万，2000～2005年较前有所下降，但仍维持在较高水平，严重威胁着哈萨克族人的身体健康[2]。由于食管癌早期无明显症状，大部分患者确诊时已达中晚期，故5年生存率较低，而早期发现并治疗的食管癌患者预后明显优于中晚期[3]，因此，建立早期的监测体系对于食管癌的诊断和治疗具有重要意义。长链非编码RNA(lncRNA)是指长度在200～1 000 nt，具有调控基因表达作用的非编码RNA。近年来研究[4]表明，大量的lncRNA在肿瘤组织与正常组织中差异表达，而且特异的lncRNA可作为肿瘤的预测因子。有研究[5]表明，与正常组织相比，lncRNA MIR663AHG在胃癌组织中表达显著上调，可能与胃癌的发生有一定的关联，但lncRNA MIR663AHG在其他肿瘤中的作用研究较少。本研究通过qRT-PCR方法观察lncRNA MIR663AHG在新疆哈萨克族食管鳞癌组织中的表达情况，并进一步分析lncRNA MIR663AHG相关的mRNA，初步探讨lncRNA MIR663AHG在新疆哈萨克族食管鳞癌中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2014年11月～2015年9月来源于石河子大学医学院第一附属医院兵团内镜中心就诊的17例食管鳞癌患者，其中哈萨克族7例(观察组)、汉族10例(对照组)。观察组男4例、女3例，年龄(66.14±5.46)岁。对照组男6例、女4例，年龄(64.43±9.25)岁。两组性别、年龄均具有可比性。所有患者经病理诊断为中分化食管鳞癌，并且在样本采集前未行任何手术治疗、放疗及化疗。取两组患者食管鳞癌组织和配对的癌旁组织，迅速放入冻存管中，并立即置入液氮中储存过夜，随后放入-80 ℃冰箱中保存备用。本研究所有样本的采集处理经石河子大学医学伦理委员会批准，并征得患者和(或)家属知情同意。

1.2 lncRNA MIR663AHG表达检测 采用qRT-PCR法。在无RNase的条件下，应用microRNA提取试剂盒提取标本中的总RNA。利用紫外分光光度计测定样本的吸光度值，以检测样本总RNA浓度和纯度。组织样本A260/A280介于1.8～2.0为合格，将合格样品保存至-80 ℃冰箱中备用。应用Fast Quant RT试剂盒对总RNA进行逆转录，合成20 μL cDNA样本，待反应结束后置于冰上。lncRNA MIR663AHG上游引物为5′-GGTACACTGGTCGACAAAACC-3′，下游引物为5′-TGGAGACGCTATCTCGGGTA-3′；GAPDH上游引物为5′-TGTTG-CCATCAATGACCCCTT-3′，下游引物为5′-CTCCACGACGTACTCAGCG-3′。qRT-PCR反应总体积为10 μL，含2×SYBR Green PCR Master Mix 5 μL，cDNA模板0.5 μL，上下游引物各0.25 μL，无核酸酶水4 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s；60 ℃退火、延伸1 min，共40个循环。用2-ΔΔCt法计算lncRNA MIR663AHG相对表达量。实验重复3次。

1.3 lncRNA MIR663AHG相关mRNA分析 本课题组前期通过北京博奥生物有限公司定制的Agilent人类lncRNA芯片V4.0(该芯片包含34 235个mRNA检测探针和40 916个lncRNA检测探针)筛选出了新疆哈萨克族食管鳞癌肿瘤组织与正常组织差异表达的lncRNA和mRNA表达谱。利用基因芯片数据，将观察组食管鳞癌及其癌旁组织中lncRNA MIR663AHG的表达信号值与筛选出的2 475个差异表达mRNA的表达信号值的趋势进行相关性分析，并筛选出与lncRNA MIR663AHG显著相关的mRNA，筛选标准：相关系数>0.8或相关系数<-0.8，并且P<0.05。

2 结果

2.1 两组lncRNA MIR663AHG表达比较 观察组食管鳞癌组织、癌旁组织中lncRNA MIR663AHG的相对表达量分别为9.07±3.60、1.18±0.71，两者相比P<0.05。对照组食管鳞癌组织、癌旁组织中lncRNA MIR663AHG的相对表达量分别为3.43±3.42、1.31±0.92，两者相比P>0.05。观察组与对照组食管鳞癌组织中lncRNA MIR663AHG的相对表达量分别为6.11±3.91、1.06±0.61，两者相比P<0.05。

2.2 与lncRNA MIR663AHG相关的mRNA 共筛选出16个与lncRNA MIR663AHG显著相关的mRNA，分别为ZNF503(r=-0.870，P=0.000)、PIK3C2A(r=-0.867，P=0.000)、HCFC2(r=-0.841，P=0.000)、WDR82(r=-0.819，P=0.000)、NDFIP2(r=-0.819，P=0.000)、USP47(r=-0.814，P=0.000)、CYFIP1(r=-0.811，P=0.000)、UBE2B(r=-0.808，P=0.000)、NIPSNAP3A(r=-0.805，P=0.000)、NAT8B(r=0.809，P=0.000)、TMEM132C(r=0.810，P=0.000)、ENDOV(r=0.816，P=0.000)、LOC388210(r=0.821，P=0.000)、KRTAP10-7(r=0.830，P=0.000)、ERVMER34-1(r=0.865，P=0.000)、CDHR5(r=0.879，P=0.000)。

3 讨论

随着分子生物学的不断发展，从基因水平对食管鳞癌发病机制的研究不断深入。哈萨克族是我国食管鳞癌高发的民族，目前有研究[6,7]表明哈萨克族与汉族食管鳞癌在基因表达方面存在一定的差异。因此，寻找与哈萨克族食管鳞癌相关的特异基因可能对降低其发病率及病死率具有重要的意义。lncRNA不仅可在多个水平参与基因表达调控[8]，而且可作为癌基因或抑癌基因在肿瘤中起到重要的作用[9,10]。大量的lncRNA被发现在肿瘤组织与正常组织中差异表达，而且特异的lncRNA可作为肿瘤的预测因子[11,12]。

本研究发现，lncRNA MIR663AHG在食管鳞癌组织及癌旁组织中均有表达，但与正常食管组织相比，lncRNA MIR663AHG在哈萨克族食管鳞癌组织中表达上调，而在汉族食管鳞癌组织中表达无差异，并且其在哈萨克族食管鳞癌组织中的表达量高于汉族。表明lncRNA MIR663AHG可能在哈萨克族食管鳞癌的发生发展中起作用，而与汉族食管鳞癌无关。lncRNA MIR663AHG的高表达可能是哈萨克族食管鳞癌发病率高于汉族的又一个重要的影响因素。lncRNA MIR663AHG在哈萨克族食管鳞癌组织中高表达，可能与哈萨克族食管鳞癌的发生、肿瘤的侵袭、转移及预后等相关。

lncRNA作为细胞内的重要调控因子，本身不具有编码蛋白质的功能，但是可以通过调控特定的基因来发挥生物学功能。本研究中，我们利用本课题组前期基因芯片的结果筛选出与lncRNA MIR663AHG相关的mRNA，以期通过对相关mRNA功能的分析来初步分析lncRNA MIR663AHG在食管鳞癌中的生物学作用。本研究共筛选出16个与lncRNA MIR663AHG显著相关的mRNA。PIK3C2A属于磷酸肌醇3-激酶(PI3K)家族，可能参与整合素依赖的信号途径及与细胞增殖、细胞凋亡、致癌转化等相关的信号途径。USP47属于泛素特异性蛋白酶(USPs)家族。目前研究发现，USPs家族中的一些成员在表观调控与蛋白质的稳定性等方面有一定的作用[13]，但是大多数USPs家族成员的生物学作用却不为人知。Zhang等[14]研究表明，下调USP47的表达能够抑制胃癌细胞的生长，USP47可能是胃癌的一个新的癌基因。CYFIP1位于人类15号染色体长臂的11.2区域(15q11.2)，该区域是染色体缺失、重排的活跃区域。CYFIP1基因与抑癌基因p53作用相似，其表达下调与乳腺癌、肺癌、膀胱癌等的发生发展有关，是一个候选的抑癌基因[15]。陈旭[16]研究也表明，CYFIP1在鼻咽癌组织中表达下调，且与鼻咽癌的临床分型、局部浸润、远处转移有关，提示CYPIF1表达下调可能与鼻咽癌的发生发展有关。其余mRNA在肿瘤中未见相关报道，但在本研究中这些mRNA在哈萨克族食管鳞癌组织中差异表达，其在肿瘤中的作用尚需进一步验证。目前对于lncRNA MIR663AHG在肿瘤中的作用尚不明确，lncRNA MIR663AHG可能通过与相关基因的相互作用在肿瘤中发挥一定的生物学作用，其在食管鳞癌中的作用尚需进一步探讨。可进一步扩大样本量，探讨lncRNA MIR663AHG的表达量与临床病理参数的相关性，并通过体内外实验进一步探讨其对食管鳞癌生物学作用的影响。

综上可见，lncRNA MIR663AHG在新疆哈萨克族食管鳞癌组织中高表达，其可能通过调节相关mRNA参与哈萨克族食管鳞癌的发生发展。

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