YAF2靶向cyclin D1表达促进肿瘤细胞增殖

侯丛丛，马晓骊，陈 虹，黄秉仁，陈 等

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 生物化学与分子生物学系, 北京 100005)

癌严重威胁人类的健康。目前手术、放疗及化疗等治疗手段的疗效并不理想。因此寻找高效的药物靶点成为当前癌研究亟待解决的难题。YY1相关因子2(YY1 associated factor 2，YAF2)参与多梳蛋白复合物(polycomb group，PcG)的组成，该复合物在调控胚胎干细胞的增殖和分化、抑制发育相关基因表达等方面发挥重要作用[1-3]。此外，YAF2参与肿瘤的发生发展。原癌基因MycN在晚期神经母细胞瘤中高表达，而YAF2与MycN的E-box相互作用，促进MycN依赖的转录[4]。YAF2也与PDCD5相互作用，激活p53诱导的细胞增殖[5]。本实验室前期研究发现YAF2促进肿瘤细胞的增殖，但具体的分子机制尚不清楚。

细胞周期蛋白D1(cyclin D1)在多种肿瘤组织中存在基因扩增或表达水平增高，促进肿瘤细胞增殖、DNA损伤修复和侵袭转移等[6-9]，是一个重要的原癌基因。本研究就YAF2是否调节cyclin D1的表达、可能的分子机制及生物学意义进行探究，进而对YAF2在肿瘤生物学中的功能有更深入的认识。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系：永生化人正常肝细胞系IHH(法国图卢兹癌症研究中心馈赠)；人肝癌细胞系SK-Hep-1、Huh7及Hep-3B(中国科学院上海生命科学院细胞中心)；人胚肾细胞系HEK 293T和结肠癌细胞系HCT116(中国医学科学院细胞中心)。

1.1.2 试剂：YAF2、GFP和β-actin抗体(Sigma公司)；cyclin D1抗体(CST公司)；人源YAF2/cyclin D1单基因siRNA套装(广州锐博公司)；PrimeSTAR HS DNA聚合酶和qPCR试剂盒(宝生物工程有限公司)；Lipo3000及Trizol(Invitrogen公司)；GoScriptTMReverse Transcription System和双荧光素酶报告基因试剂盒(Promega公司)；BCA蛋白定量试剂盒及ECL试剂盒(Thermo Scientific公司)；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，测序由北京擎科新业生物技术有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 克隆cyclin D1启动子区：以HEK 293T细胞的基因组DNA为模板，PCR扩增cyclin D1启动子区(-2 303 bp～+75 bp)，正向引物:5′-GGGGTACC CGGCTCTTTACGCTCGCTAA-3′，反向引物:5′-CCCA AGCTTGTCGTTGAGGAGGTTGGCAT-3′。用KpnⅠ和HindⅢ于37 ℃过夜酶切PCR扩增产物及pGL3-Basic载体，产物纯化后16 ℃连接3 h，转化，涂板，37 ℃倒置培养过夜。挑取单克隆进行菌落PCR和酶切鉴定，并送公司测序确认克隆序列的正确性。

1.2.2 细胞培养：细胞用含10%胎牛血清和双抗(100 U/mL青霉素和0.1 g/L的链霉素)的DMEM高糖培养基培养。细胞培养条件为37 ℃、5% CO2。

1.2.3 细胞转染：用Opti-MEM稀释质粒和Lipo3000，将质粒稀释液与转染试剂稀释液等体积混匀，室温放置5 min，逐滴加入至细胞培养液。

1.2.4 蛋白免疫印记：收集细胞，加入NP40裂解液于4 ℃裂解，离心取上清，进行蛋白质浓度定量。取30 μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，脱脂奶粉封闭，一抗4 ℃孵育过夜。次日，二抗孵育，显影检测目的蛋白表达。

1.2.5 RT-qPCR：Trizol裂解细胞，按说明书操作提取总RNA，用微量分光光度计测定RNA浓度及纯度。用Promega公司试剂盒按说明书进行反转录和qPCR实验(引物序列见表1)。

表1 qPCR引物序列Table 1 qPCR primer sequence

1.2.6 双荧光素酶报告基因实验：将细胞种至24孔板，次日，转染细胞，24 h(过表达实验)或72 h(敲低实验)后裂解细胞，按照试剂盒说明书测定报告基因活性，以海肾荧光素酶荧光强度为标准化依据。

1.2.7 流式细胞仪分析细胞周期：转染细胞48 h后，收集细胞，弃上清，预冷的70%乙醇4 ℃固定过夜。用PBS洗涤细胞，加入适量0.1 g/L的碘化丙啶，避光染色30 min，流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.8 克隆形成：选取对数增殖期的细胞，调整细胞至5×103/mL，接种于6孔板。次日，实验组中转染pFlag-YAF2及sicyclin D1，对照组转入pFlag或sicontrol。37 ℃、5% CO2培养两周后，结晶紫染色，统计集落数目。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 pGL3-cyclin D1报告基因载体构建

PCR扩增cyclin D1启动子区(-2 303 bp～+75 bp)，目的片段约2 400 bp(图1A)。用KpnⅠ和HindⅢ双酶切PCR扩增产物及pGL3-Basic空载体，胶回收确定回收效果(图1B)。构建目的克隆，挑取单菌落扩增培养，提取质粒，双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳在～4 700 bp及～2 400 bp处各有一条目的带，分别为pGL3-Basic和 cyclin D1启动子片段(图1C)。测序质粒，结果显示pGL3-cyclin D1克隆构建成功。

2.2 YAF2对cyclin D1蛋白质水平的影响

在Huh7(图2A)和Hep3B(图2B)细胞中过表达pEGFP-YAF2，内源性cyclin D1蛋白质水平明显升高；但在IHH(图2C)和SK-Hep-1细胞(图2D)敲低YAF2时，内源性cyclin D1蛋白质水平明显下降。

2.3 YAF2正向调节cyclin D1的mRNA水平

在IHH、SK-Hep-1和HCT116细胞中，用针对不同靶点的siYAF2-#1和siYAF2-#2敲低YAF2，提取总RNA，RT-qPCR检测YAF2和cyclin D1的mRNA水平。与对照组相比，IHH(图3A)、SK-Hep-1(图3B)和HCT116细胞(图3C)敲低YAF2后，cyclin D1的mRNA水平均明显下降(P<0.05)。

2.4 YAF2促进cyclin D1的启动子活性

转染pGL3-Basic的IHH细胞，与对照组相比，过表达pFlag-YAF2不能诱导cyclin D1的启动子活性，但在pGL3-cyclin D1转染的IHH细胞中，同时过表达pFlag-YAF2显著促进cyclin D1的启动子活性(P<0.05)(图4A)；与过表达pFlag-YAF2的结果相反，在转染pGL3-cyclin D1的IHH细胞中同时敲低YAF2则显著下调cyclin D1启动子活性(P<0.05)(图4B)。

2.5 YAF2通过调节cyclin D1影响细胞周期分布

在HCT116细胞中，与对照组(图5A)相比，单独敲低YAF2(图5B)后G0/G1期细胞比例明显增加(约13%)，S期比例明显减少(约8%)(表2)；而与单独过表达cyclin D1(图5C)相比较，敲低YAF2同时过表达cyclin D1(图5D)后，G0/G1期(约增加9%)及S期(约减少5.5%)的变化幅度均减少(表2)。

A:agarose gel electrophoresis of PCR amplified product of human cyclin D1 promoter region, M.DNA marker, 1.PCR product；B:agarose gel electrophoresis of double restriction enzyme digested PCR and pGL3-Basic products,M.DNA marker, 1.PCR product digested withKpnⅠ andHindⅢ， 2.pGL3-Basic digested withKpnⅠ andHindⅢ； C：agarose gel electrophoresis of recombinant pGL3-cyclin D1 plasmid cut byKpnⅠ andHindⅢ，M.DNA marker, 1.recombinant plasmid digested withKpnⅠ andHindⅢ

图1pGL3-cyclinD1报告基因载体的构建与鉴定

Fig1ConstructionandidentificationofpGL3-cyclinD1clone

pGFP-YAF2 overexpression upregulated cyclin D1 protein level in Huh7 (A) and Hep3B (B); YAF2 silencing downregulated cyclin D1 protein level in IHH (C) and SK-Hep-1 (D)

图2YAF2上调cyclinD1蛋白水平

Fig2YAF2upregulatescyclinD1proteinlevel

YAF2 silencing downregulated cyclin D1 mRNA level in IHH (A), SK-Hep-1 (B) and HCT116 (C);*P<0.05 compared with sicontrol

图3YAF2正向调节cyclinD1mRNA水平

A.promoter activity of cyclin D1 after overexpression of pFlag-YAF2 in IHH cells;*P<0.05 compared with pFlag; B.promoter activity of cyclin D1 after YAF2 silencing in IHH cells;#P<0.05 compared with sicontrol

表2 不同YAF2和cyclin D1表达水平时细胞周期分布Table 2 Cell cycle distributions under different YAF2 and cyclin D1 expression n=3)

**P<0.01 compared with sicontrol/pFlag；#P<0.05 compared with sicontrol/pFlag-cyclin D1.

HCT116 cells were transfected with either sicontrol/pFlag (A), siYAF2-#1/pFlag (B), sicontrol/pFlag-cyclin D1 (C), or siYAF2-#1/pFlag-cyclin D1 (D), and cell cycle distributions in G0/G1and S phases were detected by flow cytometry assay

图5流式细胞计量术分析不同YAF2和cyclinD1表达水平对细胞周期分布的影响

Fig5CellcycledistributionsunderdifferentYAF2andcyclinD1expressionlevelsbyflowcytometryassay

2.6 YAF2过表达促进细胞增殖

与空对照(pFlag/sicontrol)相比，在HCT116细胞中单独过表达pFlag-YAF2后细胞克隆形成数目明显增加(P<0.05)；与单独敲低cyclin D1相比，过表达pFlag-YAF2同时敲低cyclin D1(sicyclin D1)的细胞克隆形成数目增加不明显，无显著差异(图6A,B)。

3 讨论

细胞周期异常是肿瘤发生发展的一个重要标志性事件。Cyclin D1与周期素依赖的蛋白激酶CDK4/CDK6形成复合物， 磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein，Rb)，使其释放转录因子E2Fs，从而缩短细胞由G1期进入S期的时间，促进细胞增殖[10-11]。YAF2属于RYBP(ring1 and YY1 binding protein)蛋白质家族成员。研究发现，YAF2通过抑制caspase-8介导的细胞凋亡调节斑马鱼胚胎发育[12]。在晚期神经母细胞瘤中YAF2与MycN相互作用，促进MycN依赖的转录[4]。此外，YAF2通过稳定PDCD5激活p53功能，抑制结肠癌细胞增殖[5]。但截至目前，YAF2在肿瘤发生发展中的作用及机制仍然研究不多。

A, B.numbers of colony formation of HCT116 cells transfected with either pFlag/sicontrol, pFlag-YAF2/sicontrol, pFlag/sicyclin D1, or pFlag-YAF2/sicyclin D1;*P<0.05 compared with pFlag/sicontrol

图6克隆形成分析检测不同YAF2和cyclinD1表达水平对细胞增殖的影响

前期实验发现，YAF2在肝癌细胞系Huh7和Hep3B中的表达水平相对较低，在IHH和SK-Hep-1中的表达水平相对较高，因此本研究用Huh7和Hep3B进行过表达实验，在IHH和SK-Hep-1中进行敲低实验。总体来说，本研究过表达、敲低结合Western blot和报告基因的实验发现，YAF2结合cyclin D1的启动子区，在转录水平上调节cyclin D1的表达，这一结果与YAF2正性调节hGABP转录的研究相类似[13]。有研究发现，YAF2与转录因子YY1相互作用，募集PcG复合物至染色质[14]，提示YAF2可能通过参与PcG复合物，调节cyclin D1的转录，但具体的分子机制仍需进一步的探究。功能性实验的结果表明，在HCT116细胞中，敲低YAF2促进cyclin D1依赖的细胞周期G0/G1期阻滞、降低S期细胞的数目，而YAF2过表达促进cyclin D1依赖的细胞克隆形成，提示在结肠癌细胞中YAF2可能具有原癌基因活性，这与YAF2抑制HCT116细胞中p53依赖的细胞增殖的结果不一致[5]，因此，YAF2在结肠癌细胞中的功能仍需进一步的研究。

综上所述，本研究首次发现，肿瘤细胞中YAF2结合cyclin D1启动子，在转录水平上调cyclin D1的表达，加快肿瘤细胞由G1期进入S期，促进细胞增殖，提示至少在本研究的肝癌和结肠癌细胞中YAF2具有原癌基因功能，为将来靶向YAF2-cyclin D1的抗肿瘤新药研究奠定基础。

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