羧胺三唑抑制佐剂性关节炎大鼠腹腔巨噬细胞产生细胞因子

朱 蕾，段梦园，张晓娟，李 娟，鞠 瑞，郭 磊，卢 珊，叶菜英

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 药理系， 北京 100005)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以多关节进行性破坏为主要特征的慢性、系统性的自身免疫性疾病，目前尚无有效控制疾病发展的理想药物[1]。羧胺三唑(carboxyamidotriazole, CAI)是一种正处于临床研究中的非细胞毒性抗肿瘤药物，在体外和体内均有一定的抗肿瘤增殖和转移的作用[2- 3]。本课题组在深入研究CAI药理作用的过程中发现，CAI不仅具有抗癌作用，还具有较强的抗炎镇痛作用，能够显著抑制多种急、慢性炎性反应模型以及免疫炎性反应的病理过程。进一步研究发现，CAI对大鼠佐剂性关节炎(adjuvant arthritis, AA)具有明显的治疗作用，能够降低AA大鼠的关节炎指数并改善关节放射学和病理组织学损伤，提示CAI对RA可能有一定的治疗作用[4- 6]。本研究在此基础上，以AA大鼠腹腔巨噬细胞为靶细胞，研究CAI体外对AA大鼠腹腔巨噬细胞产生细胞因子的影响，以期对其治疗作用的部分机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：清洁级雄性Lewis大鼠，体质量180～210 g [北京维通利华实验动物技术有限公司，SCXK(京)2006- 0009]。

1.1.2 药品及试剂：CAI(中国医学科学院药物研究所合成)，纯度(HPLC)达99%以上。卡介苗(北京生物制品研究所)；DMEM高糖培养基(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)；胎牛血清(Gibco公司)； LPS脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和DMSO(Sigma公司)；总RNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)；反转录试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)；SYBR Green Ⅰ荧光PCR试剂盒(杭州博日科技有限公司)；TNF-α、IL- 1β和IL- 6的mRNA引物(上海基康生物技术有限公司)；TNF-α、IL- 1β和IL- 6 ELISA试剂盒(上海依科赛生物制品有限公司)；核蛋白提取和TransAMTMNF-κB 活性检测试剂盒(Active Motif公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠AA模型的建立[6]：将卡介苗于80 ℃、1 h灭活后，以高压灭菌的液体石蜡配成10 mg/mL的乳剂，充分研磨、混匀，即得弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant, FCA)，于每鼠尾根部2～3点皮内注射0.1 mL FCA致炎。给对照组大鼠注射等体积的液体石蜡。

1.2.2 大鼠腹腔巨噬细胞的制备[7]：将大鼠颈椎脱臼处死，腹腔注射预冷的PBS液15 mL，轻揉腹部后剪开腹腔，吸出腹腔洗液，1 000 r/min离心5 min，PBS液洗1次，用含10%胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞。以5×107个细胞/皿接种至10 cm培养皿中(用于核蛋白提取)，以1×107个细胞/孔接种至6孔板中(用于总RNA提取)，以1×106个细胞/孔接种至24孔板中(用于收集培养上清)，在37 ℃、5% CO2培养箱培养2 h，弃去上清，并用PBS液洗2次以除去非黏附细胞，获单层巨噬细胞。依次作如下分组：正常组、AA组、AA+DMSO组、AA+CAI 10 μmol/L组、AA+CAI 20 μmol/L组、AA+CAI 40 μmol/L组。

1.2.3 上清中TNF-α、IL- 1β和IL- 6水平的检测：按上述分组进行给药处理，同时各组细胞加入LPS(终浓度4 mg/L)进行刺激，18 h后收集上清液，-20 ℃保存，采用ELISA法检测上清中TNF-α、IL- 1β和IL- 6含量，操作按照试剂盒说明书进行。

1.2.4TNF-α、IL- 1β和IL- 6的mRNA检测：按上述分组进行给药处理，同时各组细胞加入LPS(终浓度4 mg/L)对细胞进行刺激，培养6 h后弃去上清，按照总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，然后按照反转录试剂盒操作说明反转录合成cDNA，最后按照SYBR Green Ⅰ荧光PCR试剂盒操作说明，在Bio-Rad公司IQ5上测定TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA。所用引物序列为TNF-α上游引物:5′-CTGG GCAGCGTTTATTCT-3′,下游引物:5′-TTGCTTCTTCC CTGTTCC-3′)；IL- 1β上游引物:5′-TGGACAGAAC ATAAGCCAACA-3′, 下游引物:5′-TAGATTCTTCC CCTTGAGGC-3′；IL-6上游引物: 5′-AGCCAGAGT CATTCAGAGCAA-3′, 下游引物:5′-GAAGTTGGGGT AGGAAGGACT-3′；β-actin上游引物:5′-CGAGTAC AACCTTCTTGCAGC-3′, 下游引物:5′-G CCCACGT AGGAGTCCTTC-3′。

1.2.4 核蛋白的提取和NF-κB的活性测定：按上述分组进行给药处理，1 h后加入LPS(终浓度4 mg/L)继续培养30 min，提取核蛋白并根据TransAM试剂盒说明书检测NF-κB的活性，方法简述如下：96孔板中固定NF-κB p65的保守结合位点(5′-GGGACTTCC-3′)，加入核蛋白提取液，封板，室温孵育，洗涤；依次加入抗NF-κB p65抗体及HRP标记的二抗孵育，洗涤。 最后加入显色剂，室温避光孵育2～10 min 终止反应(由蓝色变为黄色)，5 min内450 nm波长测其吸光度值。

1.3 统计学分析：

2 结果

2.1 CAI对AA大鼠腹腔巨噬细胞中TNF-α、IL- 1β和IL- 6分泌的影响

AA大鼠腹腔巨噬细胞培养上清中TNF-α、IL- 1β和IL- 6的水平显著高于正常组(P<0.01)，CAI(20、40 μmol/L)可明显降低其TNF-α、IL- 1β和IL- 6的增高水平(P<0.01)(表1)。

2.2 CAI对AA大鼠腹腔巨噬细胞中TNF-α、IL- 1β和IL- 6的mRNA影响

AA大鼠腹腔巨噬细胞中TNF-α、IL- 1β和IL- 6的mRNA水平显著高于正常组(P<0.01)；CAI(20、40 μmol/L)可明显降低其TNF-α、IL- 1β和IL- 6 mRNA的增高水平(P<0.05，P<0.01)(图1)。

2.3 CAI对AA大鼠腹腔巨噬细胞中NF-κB活性的影响

AA大鼠腹腔巨噬细胞中NF-κB p65的DNA结合活性显著高于正常组(P<0.01)，CAI(20、40 μmol/L)对NF-κB p65活性的增强具有明显抑制作用(P<0.01)(图2)。

3 讨论

大鼠AA模型是一种免疫性炎性反应模型， 是筛选和研究治疗RA药物的常用模型[6]。巨噬细胞是调节炎性反应的重要效应细胞，在免疫系统受到自身抗体或特殊抗原刺激时，巨噬细胞活化产生大量的促炎细胞因子，如TNF-α、IL- 1β和IL- 6等，这些细胞因子相互作用，形成的细胞因子网络在RA的病理生理过程起着重要作用[8- 9]。其中以TNF-α和IL- 1β最为重要。它们相互作用，诱导产生更多细胞因子，放大炎性反应；增强内皮细胞黏附分子表达，协助炎性细胞迁徙至关节腔；促进滑膜成纤维细胞和软骨细胞生成基质金属蛋白酶和前列腺素，导致软骨基质降解； 促进破骨细胞的分化和成熟，引起骨质破坏等。另外， IL- 6也是引起RA滑膜炎性反应和骨质损伤的重要促炎细胞因子[10- 11]。本研究选用能反映全身炎性免疫状态的AA大鼠腹腔巨噬细胞作为研究对象，结果显示，浓度为20和40 μmol/L的CAI能够明显降低LPS刺激的 AA大鼠腹腔巨噬细胞中TNF-α、IL- 1β和IL- 6的mRNA水平，抑制TNF-α、IL- 1β和IL- 6的分泌，提示CAI的抗关节炎作用可能与其抑制细胞因子的产生有关。

表1 CAI对AA大鼠腹腔巨噬细胞中TNF-α、IL- 1β和IL- 6分泌的影响Table 1 Effects of CAI on the secretions of TNF-α, IL- 1β and IL- 6 in the peritoneal macrophages of

#P<0.01 compared with normal group;*P<0.01 compared with DMSO-treated AA group.

#P<0.01 compared with normal group; *P<0.05, **P<0.01 compared with DMSO-treated AA group图1 CAI对AA大鼠腹腔巨噬细胞中TNF-α、IL- 1β和IL- 6的 mRNA影响Fig 1 Effects of CAI on the mRNA expressions of TNF-α, IL- 1β and IL- 6 in the peritoneal macrophages of

#P<0.01 compared with normal group; *P<0.01 compared with DMSO-treated AA group

NF-κB信号级联途径是 LPS引起炎性反应的重要通路。NF-κB是重要的核内转录因子，主要以p50/p65异源二聚体形式存在。静息状态下，p50/p65与其抑制蛋白ΙκB结合，形成无活性的复合物而存在于细胞质中。受LPS刺激后，ΙκB被降解，释放出有活性的p50/p65二聚体，活化的二聚体进入细胞核，通过与相应的炎性因子靶基因启动子区的κB位点相结合而导致炎性因子基因的过度表达。因此，阻断NF-κB的活化有望缓解RA[12- 13]。本研究结果显示，CAI可明显降低AA大鼠腹腔巨噬细胞中NF-κB p65的DNA结合活性的增强，NF-κB的活性变化和下游细胞因子的产生水平一致。提示抑制NF-κB的活性可能是CAI降低细胞因子产生的重要作用靶点，但具体机制尚待进一步研究。

综上所述，巨噬细胞是CAI发挥作用的靶细胞之一，CAI可能通过下调巨噬细胞中NF-κB的活化，干预NF-κB信号通路的某些环节，从而减少TNF-α、IL- 1β和IL- 6等促炎细胞因子的产生。CAI的抗关节炎作用可能与上述机制有关。

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