非小细胞肺癌中DAXX表达及临床意义

王 燕，田 薇，张 曙，靳 钦，刘 颖

（南通大学附属医院病理科，江苏226001）

肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤[1]，其中非小细胞肺癌占80%[2]。我国近年肺癌发病数明显增加，死亡人数达全世界的三分之一[2]。目前手术和化疗仍是肺癌的主要治疗方法，但是大多数化疗方案具有局限性，而寻找高度敏感性和特异性的生物标志物有助于肿瘤的预防、诊断及预后的判断[3]。

死亡结构域相关蛋白（death domain associated protein，DAXX）是一种保守的新型蛋白，由Yang等[4]于1997首次发现，它广泛存在于人体正常组织和细胞中，如肝脏、肾脏等，也存在于大多数肿瘤中，如淋巴瘤、宫颈癌及消化系统肿瘤等，但目前对DAXX的具体作用机制还不清楚[5]。本研究应用组织芯片联合免疫组化方法检测DAXX蛋白在非小细胞肺癌中的表达，初步探讨其表达与非小细胞肺癌发生、发展及预后的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集我科2011年1月—2012年12月135例非小细胞肺癌患者的癌组织以及对应癌旁组织，术前均未经任何放疗、化疗和免疫治疗，临床资料完整，并通过电话获得随访，随访率为100%，随访截至2017年6月。

1.2 方法 采用组织芯片系统（Quick-Ray，UT06，UNITMA，韩国），将取自单个石蜡包埋切片的核心组织活检（直径约2 mm）排列在新的石蜡块中，4μm切片，常规脱蜡、水化，抗原修复20min后自然冷却，采用免疫组化EnVision法进行检测，鼠抗人DAXX（Abcam公司），HRP标记山羊抗鼠IgG（Sigma公司），DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。结果判读：在高倍镜下（400×）计数400个细胞，记录每个细胞染色强度，计数阳性细胞比例（%）。染色强度评分标准：无着色记0分，黄色（弱阳性）记1分，浅棕色（中阳性）记2分，棕褐色（强阳性）记3分。阳性细胞比例记分标准：≤5%记0分，6%～25%记 1分，26%～50%记 2分，51%～75%记 3分，＞75%记4分。两者评分相乘，≥6分为高表达，0～5分为低表达。

1.3 统计学处理 采用SPSS 21.0统计学软件对数据进行处理分析，计数资料组间比较采用Pearson卡方检验，Kaplan-Meier生存分析绘制生存曲线，采用COX比例风险回归模型及log-rank检验进行预后分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 DAXX蛋白在非小细胞肺癌中的表达 DAXX蛋白表达定位于细胞核，非小细胞肺癌癌组织高表达108例（80.0%），癌旁组织高表达30例（22.2%），差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 DAXX蛋白在非小细胞肺癌及癌旁组织的表达（EnVision法，400×）

2.2 DAXX蛋白表达与临床病理特征的关系DAXX蛋白表达与组织病理学分级、TNM分期、原发肿瘤、淋巴结转移、远处转移以及胸膜侵犯等相关（P＜0.05），而与患者性别、年龄及组织类型无关（P＞0.05）。见表 1。

表1DAXX蛋白表达与非小细胞肺癌临床病理参数的关系 例（%）

2.3 DAXX蛋白表达与患者预后关系 Kaplan-Meier生存分析显示，DAXX蛋白高表达组患者的总生存率显著低于低表达组（P＜0.05）。见图2。单因素、多因素生存分析显示，DAXX蛋白表达程度、TNM分期、淋巴结转移及远处转移与患者预后相关（P均＜0.05），而年龄、性别、组织类型、组织病理学分级、原发肿瘤、胸膜侵犯等与预后无关（P均＞0.05）。见表2。

图2 非小细胞肺癌DAXX表达与患者预后的关系

3 讨 论

人类DAXX基因全长315 kb，其中包含7个外显子、6个内含子及4个结构域（2个配对兼性双螺旋、1个酸性氨基酸结构域、1个SPT结构域），主要定位于6号染色体短臂。DAXX蛋白含有约740个氨基酸，以120 kD（磷酸化形式）、97 kD和70 kD 3种不同分子量的形式存在[6]。

DAXX可参与基因的转录调控，并通过与多个蛋白相互作用在凋亡中发挥重要作用。因为DAXX在亚细胞间的分布不同而发挥不同的生物学活性，可促凋亡，也可抑制凋亡。最初发现DAXX是调控细胞凋亡信号途径的一种功能分子，Yang等[4]提出DAXX可作为Fas蛋白下游在胞浆中发挥促进细胞凋亡的作用，与FasDD（death domain of Fas）蛋白相互作用，FasDD和DAXX均属于Fas下游两条不同的信号通路，分别调节细胞凋亡。DAXX可与Fas死亡结构域特异性结合，其过表达可增强Fas介导的细胞凋亡，同时激活JNK通路；同时DAXX的凋亡途径对Bcl-2和JNK通路信号分子的显性负突变体敏感，进而影响凋亡。但最新研究表明，DAXX在Fas引导的凋亡中不是必要的[7]。以外，DAXX还可与ASK1（细胞凋亡信号调节激酶1）及PAR-4（前列腺细胞凋亡反应蛋白4）相互作用，分别通过JNK/p38途及磷酸化ZIP激酶诱导细胞凋亡[8]。另外，作为一些转录因子的辅助因子，当DAXX分布于细胞核时，可抑制 Pax3、ETSl、NF-KB 等转录因子，并与组蛋白去乙酞化酶II（HDAC II）、ATRX、核心组蛋白等相互作用而发挥抑制转录的功能[9-10]。研究显示，DAXX与早期胚胎发育关系密切，并有直接或间接的抗细胞凋亡的作用[11]。Chen等利用小RNA干扰DAXX表达后，HeLa细胞对Fas和UV介导的凋亡更加敏感，而DAXX过表达可抑制人白血病细胞TF-1凋亡，在急性淋巴细胞白血病细胞系内，MDM 2、DAXX以及HAUSP相互作用形成复合体，降低MDM2泛素化，从而维持对P53的抑制作用[12]。DAXX还可抑制转录因子如E2F120，p53，ETS143和Pax342等的表达[13]，发挥潜在的抗凋亡作用[14-15]。DAXX在多种肿瘤细胞中表达，并与卵巢癌、胰腺神经内分泌肿瘤及脑胶质细胞瘤等密切相关[16-17]。

表2 非小细胞肺癌患者预后的单、多因素分析

在本实验中，我们通过组织芯片技术联合免疫组化法检测了非小细胞肺癌中 DAXX蛋白的表达水平，研究结果证实，DAXX在非小细胞肺癌组织中高表达，其表达与患者组织病理学分级、TNM分期、原发肿瘤、淋巴结转移、远处转移以及胸膜侵犯密切相关，提示DAXX高表达可增强肺癌细胞的侵袭和远处转移能力。预后分析显示，DAXX高表达患者的生存时间更短，DAXX蛋白表达程度、TNM分期、淋巴结转移及远处转移为非小细胞肺癌患者预后的独立危险因素。由此可见，DAXX高表达可用于评估非小细胞肺癌患者的预后，但具体作用的分子机制及信号通路还不清楚，有待于进一步研究。

综上所述，DAXX蛋白高表达参与非小细胞肺癌的发生与发展，可作为判断患者预后的独立危险因子，可能为非小细胞肺癌治疗提供新的作用靶点。