HLA-G在乳腺癌中的表达及意义

何 煦 叶尚勉 董丹丹 李 科

乳腺癌是发病率最高的女性恶性肿瘤，也是导致女性因为癌症死亡的最主要原因。全世界每年约120万女性发生乳腺癌，其中50万女性死于乳腺癌[1]。据资料统计，直径在1 cm以内的早期乳腺癌，术后5年生存率可达90%以上，如已扩散到淋巴结，5年生存率降为71%，如果出现广泛转移，则5年生存率仅为18%[2]。

人类白细胞抗原G(Human leukocyte antigen，HLA-G)属于非经典HLA-I类白细胞抗原，在正常生理情况下，HLA-G仅在胎盘的绒毛膜细胞和其他少量的组织表达，在分化成熟的正常成人组织中无表达。在病理情况下，HLA-G可以在肿瘤、器官移植和自身免疫性疾病等情况下产生[3]。近年来HLA-G与肿瘤发生发展的关系，以及在肿瘤诊断和预后中的作用引起广泛关注。在本研究中，我们对HLA-G在乳腺癌患者中的表达进行了分析，并且探讨了HLA-G的表达与各项临床病理指标及生存率之间的关系，为进一步研究HLA-G在乳腺癌发生发展中的作用提供相关的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

235例乳腺癌患者为2012—2015年在四川省人民医院住院确诊的病人，其组织切片取自外科术后病理组织。病人平均年龄52岁，均未接受术前化疗和放疗。病人在术后均依据临床病理标准接受6个周期的辅助化疗，雌激素受体及孕激素受体(ER/PgR)阳性的病人在化疗后均接受内分泌治疗。

临床病理分期分级按照AJCC和UICC制定的TNM标准，235例乳腺癌病人中，Ⅰ期84人，Ⅱ期52人，Ⅲ期85人，Ⅳ期14人。对84例病人在治疗后进行了随访，其中15例病人在随访过程中发生死亡，随访率为36%。随访起始时间为病人出院后，终止时间为满36个月或者病人死亡，中位随访时间为26个月(4～36个月)，随访方式为门诊或电话随访。所有纳入病例均为原发性乳腺癌，转移性乳腺癌未纳入，所有病例均为病理诊断结果。研究还包括23例正常乳腺组织和18例乳腺良性肿瘤切片。

1.2 抗HLA-G单克隆抗体的制备

从人胎盘组织经两个连续抗体亲和层析柱(抗HLA-G抗体亲和层析柱和抗HLA-Gβ2微球蛋白抗体亲和层析柱)分离纯化获得天然HLA-G蛋白。然后用天然HLA-G蛋白按标准方法免疫BALA/C小鼠。再用免疫小鼠的脾细胞与SP2鼠骨髓瘤细胞株融合成杂交瘤细胞。采用有限稀释法，抗体捕获酶联免疫测定法和Western blot等方法筛选出一株分泌抗HLA-G单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为HGY[4]。该细胞株产生的单克隆经小鼠抗体分型试剂盒确定为IgG3。实验还进一步证明该抗体结合位点在HLA-G的1区域。

1.3 免疫组织化学检测

用免疫组织化学法测定乳腺癌组织中HLA-G的表达，组织用福尔马林固定，石蜡包埋，5 μm厚连续切片，常规脱蜡水化，抗原修复，封闭内源性过氧化物酶，加一抗HGY(1∶400)4℃过夜。PBS缓冲液洗3次，加S-P试剂盒，镜下显色后，用苏木素复染。每次实验都设阳性对照和阴性对照。

以癌细胞膜、细胞浆和细胞核出现棕黄色反应物判为阳性表达，由两位病理学专家在光镜下判读结果，根据显色百分比和显色信号的强度，将显色结果分为四级：(-)组织标本无染色；(+)阳性信号少于25%的癌症组织，和/或显色信号弱；(++)阳性信号在25～50%之间，和/或信号强度中等；(+++)阳性信号多于50%，和/或显色为强阳性。

1.4 宿主免疫反应评估

本研究采用乳腺癌病人肿瘤内淋巴细胞的浸润数量评估宿主的免疫反应。在5个高倍视野下，计数浸润的淋巴细胞数目，根据淋巴细胞的数量，将宿主免疫反应评分为强(+++)、中(++)、弱(+)，分别计分为3分，2分和1分。

1.5 统计学分析

统计学分析采用SPSS 18.0软件包，HLA-G表达与临床病理参数的关系采用χ2检验，生存资料分析采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验。建立Cox回归模型进行多因素分析，确定影响生存期的独立预测因素，P<0.05为差异存在统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌中HLA-G的表达

本研究采用免疫组化的方法对235例乳腺癌组织切片研究，发现66%(155/235)的病例有HLA-G蛋白的表达，其中64%(99/155)为弱表达(+)，36%(56/155)为强表达(+++)或中度表达(++)，HLA-G蛋白在正常乳腺组织和癌旁组织则无表达(图1)。

图1 乳腺癌及正常乳腺组织中HLA-G的表达(100×)Figure 1 The expression of HLA-G in breast cancer and normal breast tissues by immunohistochemistry(100×)Note：A.Strong HLA-G expression in breast cancer；B.No HLA-G expression in normal breast tissues.

2.2 HLA-G在乳腺癌的表达与病人临床病理学参数之间的关系

本研究发现HLA-G的表达与肿瘤大小、淋巴结有无转移以及疾病分期有关(P<0.05)，但是与年龄、肿瘤类型、肿瘤浸润程度、组织分化程度无关(P>0.05)(表1)。

2.3 HLA-G在乳腺癌的表达与宿主免疫反应的关系

HLA-G表达强阳性的区域淋巴细胞少，而HLA-G表达阴性的区域有大量淋巴细胞浸润。HLA-G(-)病人中，约有66%(53/80)宿主免疫反应为强或中度(++/+++)，HLA-G表达(+)的病人中，约有63%(63/99)宿主免疫反应为强或中度(++/+++)，而HLA-G表达(++/+++)的病人中，约有83%(47/56)宿主免疫反应较弱。HLA-G表达阳性的肿瘤组织与HLA-G表达阴性的肿瘤组织相比，淋巴细胞的浸润被明显抑制(图2)。分析HLA-G的表达与宿主免疫反应的关系，可见HLA-G表达(-/+)组与HLA-G表达(++/+++)组免疫反应有统计学差异(t=2.636，P=0.011)(图3)。

表1 HLA-G在乳腺癌的表达与临床病理学参数之间的关系

图2 HLA-G的表达与宿主免疫反应的关系(200×)Figure 2 The relationship between HLA-G expression and host immune response(200×)Note：A.Very few lymphocytes in tumors with strong HLA-G expression；B.Numerous lymphocytes in tumors with negative HLA-G expression.

2.4 HLA-G在乳腺癌的表达与病人生存率之间的关系

在84例随访病例中，17例HLA-G表达阴性，42例为弱表达，25例为中等或强表达。在36个月随访过程中有15例死亡，7例为HLA-G弱表达或阴性，8例为HLA-G中等或强表达。HLA-G弱表达或阴性病例的总生存率高于HLA-G强或中等程度表达的生存率(88%vs. 68%)(表2，图4)。Cox预后多因素分析显示HLA-G对乳腺癌病人是一个独立的预后指标(HR=10.2，95%CI：5.07～18.20，P=0.006)(表3)。

图3 HLA-G的表达与宿主免疫反应的关系Figure 3 The relationship between HLA-G expression and host immune responseNote：*P<0.05，when compared to the HLA-G(-/+)group.

图4 HLA-G(-/+)及HLA-G(++/+++)乳腺癌病人生存曲线Figure 4 Survival curves of breast cancer patients with HLA-G(-/+)and HLA-G(++/+++)

HLA-G expressionAliveDeadLog-rank testχ2PHLA-G(-/+)88%(52/59)12%(7/59)HLA-G(++/+++)68%(17/25)32%(8/25)4.8330.028

表3 临床病理学因素与病人生存率之间的关系

3 讨论

上个世纪八十年代末，美国西雅图大学Geraghty实验室发现了一种非经典I类白细胞抗原，称之为HLA-G。该白细胞抗原的基因同经典I类白细胞抗原的基因都位于第6对染色体的短臂上，基因和表达的产物与经典I类白细胞抗原有86%同源[5]。HLA-G与经典I类白细胞抗原相比，有两个重要特点：一是在正常生理情况下，HLA-G仅在胎盘的绒毛膜细胞和其他少量的组织，如胸腺、角膜和骨髓造血祖细胞等表达(HLA-A、-B和-C在几乎所有的有核体细胞均有表达)，在母体对胎儿的免疫耐受起重要作用，在妊娠时可以保护胎儿免受母亲免疫系统的排斥[6]；二是HLA-G不具有多态性(经典I类白细胞抗原有96种，536个等位基因，而HLA-G只有1种，仅有6个等位基因)[7]。HLA-G具有抑制自然杀伤细胞(NK)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和抗原递呈细胞(APC)的功能，是机体免疫耐受机制中重要的调节因子[8]。目前，HLA-G对机体免疫系统的抑制功能已经得到了证明，它可以与T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞等免疫细胞表面的抑制性受体免疫球蛋白样转录物2(Immunoglobulin-like transcript2，ILT2/CD85j)、免疫球蛋白样转录物4(Immunoglobulin-like transcript 4，ILT4/CD85d)和杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR2DL4/CD158d)直接结合发挥生物学活性[9]。

近年来的研究发现，HLA-G在大多数常见恶性肿瘤组织又重新出现表达[10-11]，本研究结果表明，乳腺癌病人中有较高比例的病人(66%)出现HLA-G蛋白的表达，而在正常乳腺组织和癌旁组织则无表达。在分析了乳腺癌病人HLA-G的表达与各项临床病理学参数的关系后我们发现，HLA-G的表达与肿瘤大小、淋巴结有无转移以及疾病分期有关，这些结果提示HLA-G的免疫组织化学检测可作为判断乳腺癌的一个辅助诊断指标。HLA-G在恶性病变中的异常表达机制之一可能是由于恶性转化过程而引起的基因组调控的改变[12]。

肿瘤在发生和发展变化过程中，要表达一些不同于正常组织的肿瘤抗原，免疫系统对这些发生癌变的细胞有排斥消除的功能，称之宿主的免疫监视。但在已经患上癌症病人的体内，癌细胞明显地逃过了宿主的免疫监视，这种现象称之为肿瘤的免疫逃逸[13]。研究肿瘤免疫逃逸的机理则是肿瘤生物学和肿瘤免疫学上的一个重要命题。由于HLA-G是一种免疫抑制分子，能够抑制免疫应答，从而引起肿瘤细胞的入侵和转移，因此如果肿瘤细胞出现HLA-G的异常表达，便能更好地解释肿瘤免疫逃逸机制。

在研究HLA-G的表达与宿主免疫反应的关系中我们发现，HLA-G表达阳性区域的宿主免疫反应较弱于HLA-G阴性区域，HLA-G表达阳性的肿瘤组织与HLA-G表达阴性的病例相比，淋巴细胞的浸润被明显抑制，说明HLA-G参与了宿主的免疫反应，是肿瘤细胞逃避宿主免疫反应的策略之一。另外，HLA-G的表达与乳腺癌的预后密切相关，HLA-G阴性病人的生存率明显高于HLA-G阳性病人，也表明HLA-G可通过抑制宿主免疫反应，帮助肿瘤细胞逃避宿主的免疫应答，使肿瘤易于发生转移，从而使病人生存率降低。

综上所述，本研究认为HLA-G具有较高的临床应用价值，能够用于乳腺癌的诊断以及预后的指导和监测，是一个较为理想的肿瘤标志物。