非小细胞肺癌患者血清miR-195的表达及其临床意义

蔡 静 候 玥

肺癌的发病率为肿瘤的首位，严重危害人类的健康，非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌总数的80%～85%，是中国一个重要的公共卫生问题，尽管化学治疗方法和手术技术的不断改进，但是NSCLC的5年生存率仅约15%[1]，因此，寻找一些高特异性和敏感性的生物标记物对NSCLC的早期诊断和恶性疾病的预后具有重要的临床意义。微小RNAs(microRANs)是一类由人基因组编码的长度在19～24个核苷酸的非编码小分子单链RNA，能通过与靶基因mRNA的3′-非翻译区(3-UTR)特异性地碱基互补配对结合，导致靶基因mRNA的翻译抑制或降解，从而广泛地参与转录后基因表达的负调控[2]。miRNAs异常表达在NSCLC的发生与发展中发挥重要的作用[3-4]，近年来研究发现，miR-195在NSCLC组织和细胞株表达降低，意味着miR-195可能为一种肿瘤抑制因子[5]，血清中存在着稳定而大量的miRNAs[6]，那么在NSCLC患者血清中miR-195表达情况如何？为此，本研究主要探讨NSCLC患者血清中miR-195的表达情况及其潜在的临床意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2014年1月—2016年4月成都市龙泉驿区第一人民医院100例经手术病理证实为NSCLC患者，其中鳞癌44例，腺癌56例；病理学分型：高分化37例、中分化33例、低分化30例；有淋巴结转移42例，无淋巴结转移58例；病理分期：Ⅰ～Ⅱ期60例，Ⅲ～Ⅳ期40例，并选取同期至我院体检中心体检的健康者90例为对照组，所有患者术前均未行任何放化疗、生物治疗或靶向治疗，总体生存时间为在我院确诊为NSCLC到死亡时间或随访截止时间间隔，随访起点为确诊日期，随访截止2018年4月31日，最长随访时间为49个月。所有研究者均签署知情同意书，并得到我院医学伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 标本的收集与保存 所有研究对象均空腹10 h以上，促凝管收集空腹血样5 mL，4℃离心(3 000 r/min，15 min)后取上清，分装上清于去RNA酶的EP管中并保存于-80℃冰箱中。

1.2.2 实时荧光定量PCR法测定血清miR-195的表达 按照Trizol试剂说明书提取总RNA，取总RNA 2 μg逆转录为cDNA，参照Gene Bank的基因序列，由上海英潍捷基贸易有限公司合成特异性目的基因引物；has-miR-195-5p上游引物5′-CGTAGCAGCACAGAAAT-3′，下游引物5′-GTGCAGGGTCCGGGT-3′，逆转录引物5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGAT ACGACGCCAAT-3′，按照TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq TMⅡ试剂盒说明书，采用7500荧光定量PCR仪进行模板cDNA含量的测定，以U6作为内参照，所得的值以U6标化后输入Excel软件进行分析，具体步骤参照文献报道[7]。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，方差分析两两比较采用最小显著差异法(LSD)；采用Logistic回归分析血清miR-195相对表达量与NSCLC的关系；绘制ROC曲线确定使用血清miR-195相对表达量诊断NSCLC的灵敏度和特异度；生存分析采用Log-rank检验；生存曲线使用Kaplan-Meier法；采用Cox比例风险模型进行单因素和多因素分析探讨NSCLC预后的独立影响因素，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组人群血清miR-195相对表达量的比较

与正常人群相比，NSCLC患者血清miR-195相对表达量降低(7.26±1.61vs. 4.52±1.17，P<0.01)(图1)。

图1 两组人群血清miR-195相对表达量的比较Figure 1 Comparison of serum miR-195 expression between the control and NSCLC groupsNote：Compared with the control group，*P<0.01.

2.2 不同临床病理特征NSCLC患者血清miR-195相对表达量的比较

Ⅲ～Ⅳ期NSCLC患者血清miR-195相对表达量低于Ⅰ～Ⅱ期患者(P<0.01)，有淋巴结转移的NSCLC患者血清miR-195相对表达量低于无淋巴结转移者(P<0.01)，有远处转移的NSCLC患者血清miR-195相对表达量低于无淋巴结转移者(P<0.01)。鳞癌与腺癌不同分化程度、不同性别、年龄、有无吸烟史，患者之间的血清miR-195相对表达量无统计学差异(P>0.05)(表1)。

表1 NSCLC患者血清miR-195相对表达量与临床病理特征的关系

2.3 血清miR-195相对表达量与NSCLC的关系

以是否为NSCLC为因变量，以血清miR-195相对表达量为自变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示，校正年龄、吸烟、病理分期、淋巴转移等因素后，miR-195相对表达量(OR=0.526，95%CI：0.415～0.697；P=0.007)是NSCLC的保护因素。

2.4 ROC曲线分析血清miR-195相对表达量对NSCLC的预测价值

对血清miR-195相对表达量进行ROC曲线分析以及计算曲线下面积(AUC)，血清miR-195相对表达量的AUC为0.875(95%CI：0.826～0.923；P=0.004)，截断值取6.64时，诊断NSCLC灵敏度为87.60%，特异度为68.40%(图2)。

2.5 NSCLC患者中血清miR-195不同表达量的生存曲线

以血清miR-195的表达水平的中位数(4.38)作为阈值，将100例NSCLC患者分为高表达组和低表达组，血清中高表达miR-195的NSCLC患者中位生存时间为38.6个月(95%CI：32.3～39.8个月)，明显长于血清中低表达miR-195的NSCLC患者组(22.9个月，95%CI：18.5～27.3个月)(P<0.01)(图3)。

2.6 NSCLC患者预后的影响因素分析

单因素分析结果提示病理类型、病理分化、病理分期、淋巴转移、远处转移和血清miR-195表达量与NSCLC患者预后明显相关(P<0.05)；多因素分析结果提示病理类型、病理分化、病理分期、淋巴转移、远处转移和血清miR-195表达量是NSCLC患者预后的独立影响因素(表2)。此外，在血清中高表达miR-195的NSCLC患者中，病理类型(HR=2.674)、病理分化(HR=3.112)、病理分期(HR=3.998)、淋巴转移(HR=3.865)和远处转移(HR=3.664)均是NSCLC患者预后的影响因素；在血清低表达miR-195的NSCLC患者中，病理类型(HR=2.805)、病理分化(HR=3.167)、病理分期(HR=4.103)、淋巴转移(HR=3.789)和远处转移(HR=3.708)均是NSCLC患者预后的影响因素。

图2 血清miR-195相对表达量诊断NSCLC的ROC曲线Figure 2 ROC curve for predicting NSCLC with serum miR-195 expression

图3 NSCLC患者中血清miR-195高表达组和低表达组生存曲线的比较Figure 3 Comparison of survival curves between high expression and low expression of miR-195 groups

CharacteristicsUnivariate analysesHR95% CIPMultivariate analysesHR95% CIPGender1.2940.689～1.6320.473Age1.1850.532～1.4290.517Smoking1.5310.794～1.9970.115Histology2.7361.284～3.9250.0322.1161.205～3.0920.044Pathological grade3.1252.567～4.2230.0112.9951.869～3.8920.019TNM stage4.0122.753～6.6720.0024.1072.795～6.3240.008Lymphatic metastasis3.7942.316～5.6380.0063.6852.126～4.9370.005Distant metastasis3.6692.243～6.0150.0033.5292.216～5.8530.007Serum miR-1950.5530.316～0.8630.0090.6150.324～0.7830.011

3 讨论

miR-195位于染色体17p13.1上，是miR-16/15/195/424/497家族中的一员，在肿瘤的形成过程中发挥重要的作用，Sun等[8]研究发现，在结肠癌组织中，miR-195表达下调，其通过抑制YAP1的表达，进而抑制结肠细胞的增殖、迁移和侵袭；Chen等[9]研究发现，胆管癌患者血清miR-195表达量低于正常健康者，并且与胆管癌的病理分级、淋巴转移、TNM分级和预后密切相关；Yan等[10]研究发现，在肝细胞癌组织和肝细胞癌细胞株中，miR-195表达均下调，其通过AEG-1途径促进肝细胞癌细胞株的增殖；miR-195在胃癌、胰腺癌中表达也均下调，故许多学者认为，miR-195为一种抑癌因子。然而，有学者发现[11]，miR-195在慢性淋巴细胞白血病中表达上调，故miR-195也可以作为一种致癌因子参与肿瘤的发生发展。

近年来肺癌的发病率持续升高，已跃居恶性肿瘤死因的第1位，而NSCLC占肺癌的大多数，吸烟、大气污染、电离辐射、遗传因素等均是肺癌的危险因素，但是具体病因至今尚不完全明确。近年来，有学者发现，miR-195在NSCLC组织和细胞株中表达降低，并通过多种途径抑制NSCLC的增殖和迁移侵袭，如miR-195与CHEK1结合抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭[12]，miR-195与IGF1R或者细胞周期蛋白D3结合抑制NSCLC细胞的增殖和转移[13-14]。miRNAs在血清中稳定表达，能抗RNase的降解，反复冻融后miRNAs含量均无明显变化，相对于癌组织，血清样本在临床工作中比较容易获得，对病人创伤小，血清miR-195在NSCLC患者中的表达情况目前研究较少。Zhang等[15]研究发现，在无吸烟史肺腺癌女性患者中，血浆miR-195的表达量降低，血浆miR-195表达量增加能改善肺腺癌的总体生存率。也有研究发现[16]，与正常对照组相比，NSCLC患者血细胞中的miR-195相对表达量降低，本研究结果与此相一致。本研究发现与正常人群相比，NSCLC患者血清miR-195表达量降低。Landi等[17]研究发现，腺癌组织中miR-195表达量高于鳞癌组织，而本研究发现，血清miR-195相对表达量在鳞癌和腺癌患者中无明显差异，在高分化、中分化、低分化患者中也无明显差异，造成这一结果的差异可能为人群的选择及人种的差异等。本研究还发现，Ⅲ～Ⅳ期NSCLC患者血清miR-195相对表达量低于Ⅰ～Ⅱ期患者，有淋巴结转移和远处转移的NSCLC患者血清miR-195相对表达量低于无淋巴结转移和远处转移者，进一步说明miR-195可能作为抑癌因子抑制NSCLC的增殖和转移。Logistic回归分析提示，血清miR-195相对表达量与NSCLC密切相关，ROC曲线结果进一步表明，当血清miR-195相对表达量为6.64时，其诊断NSCLC的灵敏度为87.60%，特异度为68.40%，表明血清miR-195有望成为诊断NSCLC的潜在分子标记物。

miR-195不但与NSCLC的发病和转移有关，还与NSCLC的预后相关，本研究通过对NSCLC病例的随访发现，血清中高表达miR-195的NSCLC患者中位生存时间明显长于血清中低表达miR-195者，在多因素分析中，校正肿瘤病理分期、有无淋巴结转移及远处转移等临床分期等因素后，血清miR-195水平是NSCLC预后的独立影响因素，具体机制仍需基础研究及大规模临床研究证实。

综上所述，本研究发现，NSCLC患者血清miR-195表达量降低，并且血清miR-195表达量与NSCLC的分期、有无淋巴转移及有无远处转移相关，是影响NSCLC预后的独立因子，提示血清miR-195可能作为NSCLC潜在的早期诊断、预后评价的分子标志物。