慢性脑低灌注致大鼠肠黏膜损伤及claudin-3表达变化的研究

张 棋，舒佳惠，欧阳梦琪，王庆松

慢性脑低灌注（CCH）是缺血性脑损害的重要病理生理基础，也是引发血管性认知障碍等卒中后神经血管功能障碍的常见危险因素和病理生理机制[1-2]。脑血管病相关消化道症状临床常见，半数以上卒中患者可出现吞咽困难、溃疡、便秘或胃肠道出血等并发症[3]；另一方面，肠道作为应激反应的中心器官之一，肠黏膜屏障及肠道功能改变在神经功能调节、炎性反应调控、机体功能维持中有重要意义[4-5]。虽然研究显示脑血管病后急性期存在肠屏障损伤、肠通透性增加及紧密连接蛋白表达减少等病理生理变化[6]，但有关急性缺血性脑损害后CCH状态对肠黏膜的持续性损害效应目前尚未见报道，而进一步探讨CCH所致肠黏膜屏障及功能改变，有助于深入认识卒中相关神经血管功能障碍的相关机制、探寻有效防护措施。因此，本研究拟探讨CCH致大鼠肠黏膜形态学改变及紧密连接蛋白claudin-3表达变化及其相关性，初步揭示CCH对实验动物肠黏膜屏障及功能改变的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠 80 只[清洁级，体重（260±20）g]，购自成都市达硕实验动物中心，动物合格证编号：SCXK（川）2015-030。适应性喂养1 w后，随机分为Sham组（32只）和CCH组（48只）。

1.2 CCH模型制备 在前期研究工作的基础上，采用双侧颈总动脉永久结扎法（BCCAO）建立CCH模型[7]。Sham组方法同前，但双侧颈总动脉只分离而不结扎。造模后，Sham组大鼠无死亡，CCH组死亡10只。各组再按照观察时间不同分为如下亚组：（1）Sham 1 w 组（n=8）；（2）Sham 4 w 组（n=8）；（3）Sham 12 w 组（n=8；（4）Sham 24 w 组（n=8）；（5）CCH 1 w组（n=10）；（6）CCH 4 w 组（n=9）；（7）CCH 12 w 组（n=10）；（8）CCH 24 w 组（n=9）。

1.3 肠组织标本的制备 各亚组在CCH建模后相应时点，麻醉大鼠，沿腹中线剪开，距回盲部5 cm处取回肠末段组织（长度1 cm），生理盐水漂洗，4%多聚甲醛固定（24 h），制成厚度4 μm的石蜡标本、切片，用于HE染色及免疫荧光染色。

1.4 HE染色 肠标本切片脱蜡后，苏木精染色，分色后伊红染色，光镜下观察组织形态学变化，Chiu肠黏膜损伤评分法进行病理损伤评估[8]。

1.5 免疫荧光染色观察claudin-3 肠标本切片脱蜡后，使用枸橼酸钠缓冲液（pH=6.0）抗原修复；封闭 30 min后，直接滴加兔抗 claudin-3抗体（1∶100，ab15102，英国Abcam公司），4℃孵育过夜；PBS漂洗 5 min×3 次；滴加二抗（1:1000，美国 Invitrogen 公司），37 ℃恒温箱孵育 1 h；PBS漂洗 5 min×3次；DAPI室温染色5 min，PBS漂洗5 min×3次后封片。使用荧光显微镜结观察及图像采集，并使用Image J进行分析。

1.6 统计学方法 应用SPSS 23.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两变量相关性采用Pearson相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 回肠组织形态学变化 Sham组可见回肠黏膜结构完整，绒毛呈指状且排列较整齐。而CCH组1 w时回肠绒毛变粗变钝；随时间延长，4 w、12 w时，黏膜下间隙扩大，绒毛顶端部分脱落；24 w时，肠绒毛缩短且增粗明显，固有层及其血管暴露（图1）。按照Chiu肠黏膜损伤评分，CCH组回肠黏膜较同时间 Sham组损伤明显（P＜0.01），CCH组中，4 w、12 w及24 w 3个亚组间比较无统计学差异，但较1 w时损伤显著加重（P＜0.01，表1）。

2.2 claudin-3免疫荧光染色结果 claudin-3完整分布于Sham组回肠黏膜上皮细胞间隙，CCH组上皮细胞间claudin-3明显缺失（P＜0.01），1 w时最显著，随时间延长，CCH组claudin-3表达量逐渐升高，但均较同时间Sham组显著减少（P＜0.01，表2）。

2.3 肠黏膜损伤程度与claudin-3表达强度相关性分析 Pearson相关分析结果显示，所有实验大鼠回肠黏膜损伤程度与claudin-3表达强度呈负相关（r=-0.819,P＜0.05）。

图1 各组回肠黏膜组织HE染色结果(100×)

表1 两组不同时间回肠黏膜HE染色Chiu评分比较

3 讨论

卒中会引起免疫抑制，导致肠屏障的破坏，影响肠道蠕动和渗透性，使机体易受细菌感染[9]，这可能与肠黏膜屏障完整性破坏密切相关。本研究发现，CCH组回肠黏膜存在明显损伤，CCH后1 w肠绒毛开始变粗变钝，随后损伤加重，表明CCH可导致持续的肠黏膜损伤，4 w时最明显，此后损伤不继续加重，但持续长达至少24 w。Tascilar等[10]研究表明，急性缺血性卒中导致肠黏膜绒毛损伤、细菌移位，提示急性缺血性脑损害后的CCH状态对肠黏膜的长时间持续性损伤可能会造成肠道通透性增加，诱发肠道炎症反应及细菌移位，使机体其他组织系统易受感染而加重病情。

表2 两组不同时间回肠黏膜荧光染色平均光密度比较

各种应激发生时，胃肠道最早发生缺血，易较早受损或衰竭，又最后得到恢复[11]，其中胃肠道黏膜屏障最易受到损伤。肠黏膜屏障能防止肠道内的有害物质如细菌和毒素进入生物体内其他组织、器官和血液循环系统，而完整的肠黏膜机械屏障是其发挥保护作用的结构基础。紧密连接作为肠黏膜机械屏障的重要组成部分，以细胞-细胞黏附的方式连接肠黏膜上皮细胞发挥屏障作用[12]。Claudins家族是紧密连接最重要的蛋白质，claudin-3在人和大鼠的肠上皮连接处高度表达。本研究发现，CCH组claudin-3的表达显著减少（P＜0.01），CCH后1 w时claudin-3表达减少最显著，4 w、12 w后有所回升，24 w时较1 w虽明显回升（P＜0.05），但仍低于同时间Sham组（P＜0.01），提示CCH可致长时间肠黏膜claudin-3表达减少，与Lu等[13]的研究结果一致，可能与肠黏膜的损伤有密切关系。相关性分析也显示，回肠黏膜损伤程度与claudin-3表达强度呈负相关（P＜0.05），提示claudin-3可能被用作CCH引发的肠黏膜损伤标志物[14]。

综上所述，CCH可引发大鼠回肠黏膜长达24 w的持续性损害，肠黏膜claudin-3表达明显减少，且肠黏膜损伤程度与claudin-3的表达水平呈负相关，提示claudin-3表达水平或可成为CCH致肠黏膜损伤的重要病理标志。