生姜提取物抗氧化应激的实验研究

粟 君，马 萍，罗建勋，贾亚楠，徐 立

氧化应激（oxidative stress）是指体内氧化与抗氧化作用失衡，产生大量氧化中间产物，引起一系列的氧化反应。氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素[1]。氧化应激与多种人类疾病有关，如癌症、帕金森病、阿尔茨海默症、动脉粥状硬化、心力衰竭、心肌梗塞等[2]。部分天然植物产物有很好的抗氧化应激作用，如生姜中的生姜精油，姜辣素，生姜酮等化学成分，均具有抗氧化应激的作用；酚羟基化合物具有还原性，能够清除氧自由基[3]。本研究探讨了生姜提取物对H2O2诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)氧化应激损伤的预防保护作用。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 生姜购买于重庆农贸批发市场，产地为重庆，品种为渝姜1号，烘干、粉碎、备用；乙醇、乙酸乙酯、丙酮、石油醚（重庆钛新化工有限公司，AR）；CCK-8试剂盒（索莱宝生物科技有限公司）；DMEM 培养基（Hyclone公司）；胰蛋白酶、灭活胎牛血清（杭州四季青公司）；HUVEC（上海默赛飞生物科技有限公司）。

KQ700DB数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；XT-100高速多功能粉碎机（浙江永康市红太阳机电有限公司）；R-210/215旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司）；DLSB-10L/20冷却循环真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；Lab-1C-50E冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；I Mark酶标仪（Bio-Rad）；HERA cell 150 型 CO2培养箱(美国 Thermo公 司)；OptimaL-100XP 型 超 速 离 心 机 （Beck-man）；TS100型倒置生物显微镜(日本Nikon公司)。

1.2 生姜提取物的制备 采用系统溶剂分离法，由亲脂性到亲水性或低极性到高极性的次序组成溶剂系统，依次提取分离不同活性组分。将适量生姜粉（40目）加入100%乙醇，浸泡3 h，收集上清液，得到总提取物；再用石油醚、丙酮和乙酸乙酯等有机溶剂萃取分离提取液，得到不同的组分。

1.3 细胞培养 5%CO2、37℃恒温培养箱中常规培养HUVEC细胞，每2～3 d消化传代1次。待细胞铺满培养瓶底约80%时，弃培养液，PBS洗涤细胞1遍，0.25%胰蛋白酶液消化2～3 min，加少量含血清的新鲜培养液，终止消化。吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成单细胞悬液。在细胞悬液中加新鲜细胞培养基，5%CO2、37℃培养，选取对数生长期的细胞用于以下实验。

1.4 氧化应激损伤细胞模型的建立 选取对数生长期的 HUVEC，调整为 5.0×104个/ml，接种于 96 孔细胞板上，200 μl/孔，5%CO2、37 ℃培养 24 h。 分别加入终浓度为 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mmol/L 的 H2O2，继续培养4 h后，采用CCK-8还原法检测细胞存活率。每组设3个复孔，结果取平均值，计算不同浓度H2O2对细胞增殖的抑制率（%），以细胞增殖抑制率为50%（IC50）的 H2O2浓度作为后续实验的H2O2浓度。

1.5 生姜提取物抗氧化应激实验 以硫辛酸为阳性对照药物，将HUVEC随机分为阳性对照组（硫辛酸浓度分别为 0.5、1.0、5.0、10.0 μg/ml）和生姜总提取物组(生姜总提取物浓度分别为0.5、1.0、5.0、10.0 mmol/L)。均预培养24 h后，加入1 mmol/L H2O2诱导氧化应激损伤，继续孵育4 h后，采用CCK-8还原法检测细胞存活率。每组设3个复孔，结果取平均值。

根据上述实验结果，以生姜总提取物抗氧化应激作用最强浓度，确定生姜提取物各组分的实验浓度，进行抗氧化应激实验，方法同上。

1.6 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件分析，实验数据以±s表示，组间比较采用方差分析和两两比较t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生姜提取物结果 得到总提取物和F1～F6共6个组分。总提取物为具有生姜刺激性气味的稠膏，棕褐色；F1～F6组分为棕褐色透明液体。

2.2 不同浓度H2O2对HUVEC增殖的抑制作用随着H2O2浓度的增加，H2O2对HUVEC增殖抑制作用逐渐增强，呈现出浓度依赖性，H2O2诱导HUVEC氧化应激损伤的IC50为1 mmol/L。见表1。

2.3 生姜提取物抗氧化应激实验结果 无论是作为阳性对照药物的硫辛酸，还是生姜总提取物，均随着给药浓度的增加，HUVEC增殖率逐渐增强，提示抗H2O2氧化应激损伤的所用逐渐增强，并且均呈现出浓度依赖性。见表2。

因为生姜总提取物抗氧化应激作用最强浓度为10 mmol/L，所以确定生姜提取物各组分的实验浓度也为10 mmol/L，进行抗氧化应激实验。结果显示，随着组分极性的增加，H2O2对HUVEC增殖的抑制作用逐渐降低，细胞增殖率逐渐增大，以F5组分的抗氧化应激活性最高（表3）。

表1 不同浓度H2O2对HUVEC增殖的抑制作用(%)

表2 阳性对照组与生姜总提取物组细胞增殖率比较

表3 生姜提取物各组分抗氧化应激实验结果

3 讨论

氧化应激是由自由基在体内引起的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素[4]。氧在细胞代谢过程中部分还原为活性氧（ROS），在氧化应激中，ROS似乎参与了触发或维持疾病状态[5]。

生姜的主要化学成分有姜精油、姜辣素和二苯基庚烷类化合物，如4-姜烯酚shogaols和姜酮Zingerone B[6]。二苯基庚烷类化合物有多种药理活性，如抗氧化应激和细胞毒活性。何文珊等[7]从生姜中分离出一个新的二苯基庚烷类化合物，并且证明此化合物有很强的抗氧化应激活性。王丽[8]对母姜与子姜化学成分分析及其抗氧化活性研究表明，生姜清除DPPH自由基能力强的组分，大部分集中在中等极性偏上部位。

本研究共得到生姜总提取物和F1～F6共6个组分。总提取物为具有生姜刺激性气味的稠膏，棕褐色；F1～F6组分为棕褐色透明液体。抗氧化应激实验结果也证实，生姜总提取物具有显著的抗氧化活性，且其抗H2O2氧化应激损伤的强度与硫辛酸相同，并且也呈现出浓度依赖性。

在生姜提取物F1～F6共6个组分中，F1、F2和F3属于低等极性和中等极性的组分，F4属于中等偏上极性的组分，F5、F6属于高等极性的组分。进一步分析生姜提取物各组分的抗氧化应激活性发现，随着组分极性的增加，抗氧化应激活性逐渐增大，以F5组分的抗氧化应激活性最高。与王丽[8]对生姜抗氧化活性研究结果相似，即抗氧化应激活性最强的组分，属于中上极性部位。F6组分抗氧化应激活性低，可能是由于F6组分属于各组分提取后剩余部分，所含抗氧化应激物质较少有关。

综上所述，生姜提取物具有较强的抗氧化应激作用，可减轻H2O2诱导的HUVEC氧化应激损伤；各提取物中，以F5组分的抗氧化应激活性最强。