HIF-1α信号通路参与胎盘内皮增生的可能机制

柏 青，黄尤光，李 涓，邢小芳，李顺序，黄 晶，王永梅

不明原因复发性流产(URSA)当前在临床上比较常见，占反复流产的50%左右[1]。该病是指与同一性伴侣连续发生≥3次自然流产，且不存在解剖、内分泌、染色体和自身免疫功能异常以及生殖道感染等病因[2-3]。目前其具体的发病机制还不明确，导致治疗效果不佳。胎盘绒毛血管的协调发育与妊娠结局显著相关，多数流产产妇存在绒毛血管发育异常，表现为绒毛毛细血管数目减少或功能障碍[4-5]。现代研究表明，胎盘内皮增生过程中，血管机能不全可能是导致流产的原因之一。缺氧对滋养层细胞相关的侵袭和分化过程具有重要的调节作用，妊娠过程中的胎盘发生是在相对缺氧的环境中进行的，推测氧信号调节通路可能在流产的发病机制中发挥一定作用[6-7]。缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是哺乳动物和人体内的核转录因子，在缺氧时，能够激活缺氧信号通路，使细胞适应缺氧环境，参与多种与血管形成有关的疾病[8-11]。本研究探讨了HIF-1α信号通路参与胎盘内皮增生的可能机制，希望有利于阐述不明原因复发性流产的发生机制。

1 对象与方法

1.1 研究对象 （1）观察组：选择2014年 2月～2018年2月在医院诊治的不明原因的反复自然流产产妇78例，纳入标准：夫妻双方染色体检查正常；近3个月内未使用过甾体类激素；连续自然流产＞3次，宫颈分泌物检测支原体、衣原体为阴性；性激素和垂体激素正常；精液常规检查无异常。排除标准：生殖器有器质性病变；出现流产症状且B超检查提示孕囊无原始心血箭搏动；孕周≤12 w。（2）对照组：另选择同期在本院门诊行人工流产术产妇78例，纳入标准：有至少一次的正常妊娠史，既往无自然流产、死胎、死产及早产等异常孕育史；月经周期28～30 d，月经规律，量、色均正常；B超检查提示胚胎发育正常；无先兆流产症状；排除感染及染色体、内分泌、自身免疫异常等疾病。

两组一般资料比较无显著差异(P＞0.05，表1)。本研究得到了所有产妇的知情同意，医院伦理委员会也批准了此次研究。

1.2 胎盘绒毛标本采集 胎盘娩出后，立即取胎盘母面中央绒毛组织块约1 cm×1 cm×1 cm，漂洗后，用10%中性福尔马林溶液固定≥24 h，梯度酒精脱水后石蜡包埋，采用5 μm连续切片，4℃保存。

1.3 免疫组化实验 样本采用常规二甲苯脱蜡，梯度酒精至水化，修复抗原。PBS液洗×3次，3%过氧化氢室温孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性。滴加正常山羊血清室温孵育10 min，除非特异性染色。滴加浓度为1∶100兔抗人单克隆抗体VEGF、HIF-1α(一抗)，4 ℃过夜。PBS 液洗×3 次，滴加生物素标记山羊抗兔IgG(二抗)，37℃孵育15 min。PBS液洗×3次，滴加辣根酶标记链霉素卵白素工作液(酶标链亲和素)，37℃孵育 15 min。PBS液洗×3次，DAB显色，苏木精复染，梯度酒精脱水，中性树胶封片。以PBS替代第一抗体作为阴性对照，VEGF、HIF-1α蛋白主要表达于细胞胞浆及胞膜，部分可见细胞核着色，为浅黄至棕色颗粒，每例标本在400倍光镜下随意选取10个视野，计数视野中100个细胞中的阳性细胞数，取其平均数求为阳性百分率，积分 0～1 分为(－)；2～3 分为(+)；4～5 分为(++)；＞5分为(+++)，阳性率=[(++)+(+++)]例数/总例数×100%。将切片置于40倍显微镜下，确定染色最高血管密度区域；然后置于200倍显微镜下，选择3个最高血管密度区进行微血管计数，求其平均值作为该患者的微血管密度(MVD)值。

1.4 统计学方法 应用SPSS22.00统计软件分析，计量数据以±s表示，计数数据以频数和百分率表示，组间比较分别行t检验或χ2分析；相关分析采用Spearman等级相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VEGF和HIF-1α表达阳性率比较 观察组VEGF和HIF-1α阳性率都低于对照组(P＜0.05，表2)。

2.2 MVD密度比较 观察组MVD密度为(27.49±5.19)%，显著低于对照组(39.58±4.59)%(P＜0.01)。

2.3 相关性分析 观察组中，Spearman等级相关分析显示，MVD与VEGF、HIF-1α阳性率呈显著正相关(P＜0.05)，VEGF与HIF-1α阳性率呈显著正相关(P＜0.05)。见表3。

表1 两组一般资料比较(n=78)

表2 两组VEGF和HIF-1α阳性率比较(n=78,%)

表3 观察组相关性结果(r,n=78)

3 讨论

成功的妊娠取决于良好的胎盘生长和发育，包括胚胎形成、胎儿发育及其与母体内适应性改变[12]。胎儿发育所需的营养全部来自于胎盘，胎盘内皮增生和功能调节是保证胎儿从母体获得充足氧气和营养物质的关键，因此，胎盘的形成是妊娠成功的关键[13]。相关研究表明，妊娠早期胎盘发育是在相对缺氧的环境中，胎盘局部氧感受和信号调节系统对胎盘内皮增生发挥重要的调节作用[14-15]。HIF-1能转录活性核蛋白，主要参与调节氧稳态。VEGF为一种同型二聚体糖蛋白，在血管内皮细胞特异性结合生长因子受体，促进血管的再生，对维持血管的正常形态和功能有积极作用[16]。

本研究结果显示，观察组VEGF和HIF-1α阳性率都低于对照组，Spearman等级相关分析显示VEGF与HIF-1α阳性率呈显著正相关，说明不明原因的反复自然流产可能与VEGF与HIF-1α的低表达有关。从机制上分析，HIF-1α可上调VEGF相关的基因转录，促进血管增生，适应缺氧[17]。在缺氧时，内皮细胞产生HIF-1α，诱导VEGF和一些糖酵解相关酶的表达，使血管增生，增加供氧、供血和能量，改善缺氧环境[18-19]。HIF-1α可广泛参与哺乳动物细胞中缺氧诱导产生的特异应答，调控多种基因的缺氧诱导表达，机体对缺氧产生适应。如果HIF-1α低表达，下游靶基因的调控活性会下降，胎盘增生出现障碍，滋养细胞表型转换障碍，影响胎盘正常功能的发挥，HIF-1α调节VEGF过程出现障碍，胎盘内皮不良增生，影响胚胎着床及早期发育，从而导致不明原因复发性流产的发生。

本研究发现，观察组胎盘绒毛组织的MVD密度低于对照组，表明不明原因的反复自然流产可能与胎盘绒毛组织的微血管密度低有关。从机制上分析，胎盘微血管发育不良及血管密度减少，造成母体与胎儿血氧等物质交换障碍，胎盘发育受阻而导致流产，表明MVD减少是造成流产的的原因之一[20]。Spearman等级相关分析显示，观察组的MVD密度与VEGF、HIF-1α阳性率呈显著正相关性，提示反复自然流产孕妇胎盘组织MVD密度降低可能是由VEGF、HIF-1α低表达引起的。人体早期的胎盘内皮增生是发生在一个相对缺氧的环境中，其增生发育经历了一个氧浓度从低到高的梯度变化过程，氧浓度的变化可能是滋养细胞分化及胎盘血管网形成过程中一个重要的调节因素。氧浓度较低时，滋养细胞开始增殖；氧浓度较高时，分化侵袭表型的滋养细胞，慢慢浸润到子宫内膜，使血管再生，为胎儿提供发育所需的营养[21]。本研究表明，绒毛组织中VEGF与HIF-1α的低表达会导致滋养细胞的表型转换障碍、血管生成受阻、血管密度减少，从而引起血管重铸障碍，胎盘灌注不足引起流产。

总之，胎盘内皮增生是胚胎发育的基础，HIF-1α信号通路可能参与胎盘内皮增生过程，其低表达可能与不明原因复发性流产有关。