miR-182抑制HES激活Notch信号协调TGF-β信号途径促进急性川崎病

吕典一 武付霞 陈凤仪

川崎病(kawasaki disease，KD)又称皮肤黏膜淋巴结综合征(mucocutaneous lymph node syndrome，MCLS)，是儿科常见的一种以全身性血管炎为主要病理改变的急性发热性出疹性疾病。相关研究表明，KD的发生与急性免疫功能失衡有关[1]。Treg细胞属于T细胞亚群，外周血叉头样转录因子3(forkhead box protein3，Foxp3)是其主要标志物之一。而Jagged1介导的Notch激活可以抑制人类静脉内皮的增生。研究表明，转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)通过诱导Foxp3表达，促进活化的CD4+T细胞向Treg细胞分化，而TGF-β与白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)共同作用可以抑制Treg细胞产生，并诱导初始T细胞分化为Th17细胞[2]。TGF-β信号途径与Notch信号途径间存在对话通路，可以在多种细胞中协同作用，共同调节目标基因表达。相关研究表明，Notch信号途径可以上调Foxp3蛋白的表达[3]。

研究表明miR-23a 、miR-130a和miR-125b在川崎病患者外周血清中均有表达[4-5]，通过对川崎病人血液样本外泌体检测，发现miR-1246、miR-4436、miR-197、miR-671表达明显上调。通过高通量筛选发现miR-182在川崎病急性发病期显著上调，结合目前国际上相关川崎病的miRNA靶标研究，本研究对miR-182在急性川崎病发生及与川崎病患者临床特征的研究进行探讨，旨在为急性川崎病检测与治疗提供新靶点。

对象与方法

一、对象

选取2016年7月至2018年6月本院收治的急性期KD患儿(发热5～6天)21例为KD急性组，诊断标准参照2015年第七版实用儿科学[11]其中男12例，女9例；平均年龄(23.2±18.4)岁。选取同期于本院治疗的治愈期KD患儿14例KD治愈组，平均年龄(20.9±19.1)岁，男8例，女6例；同时选取健康儿童16例为正常对照组，平均年龄(22.3±10.1)岁,男11例，女5例。三组对象的年龄、性别等一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。纳入标准：(1)无肾病综合征、先天性免疫缺陷病，过敏性疾病等免疫系统疾病；(2)近6个月未使用影响免疫功能的药物。本研究经本院伦理委员会批准，且患儿监护人知情同意并签署知情同意书。

二、方法

1.血样采集：采用肝素钠抗凝采血管收集患儿入院时急性期、治愈期及正常对照组儿童清晨空腹静脉血3ml。KD急性组患儿于静脉注射丙种球蛋白前l天抽血。

2.流式细胞法检测外周血Treg细胞比例：取两个流式细胞检测管，分别标记为Treg细胞管和阴性对照管。两管分别加入100 μl血、20 μl CD4-FITC和20 μl CD25-PC5，剧烈蜗旋，室温下避光孵育15 min。于Treg细胞管中加入100 μl破膜剂I，剧烈蜗旋，室温下避光孵育15 min；阴性对照管中加入磷酸盐缓冲液(PBS) 2 ml，20 ℃ 300g离心5 min，弃上清。Treg细胞管中加破膜剂II 100 μl，室温下孵育5 min，轻轻振荡1～2 s；两管分别加试剂20 μl Foxp3-PE、Mouse IgG1-PE，轻轻振荡，室温避光孵育15 min，两管均加PBS 2 ml，20 ℃300g离心5 min，弃上清，加500 μl PBS，4 ℃冰箱保存，24 h内上机检测。

3.qRT-PCR检测：取KD急性组、KD治愈组和正常对照组血清标本各0.5 ml，采用TRIzol法提取血清总RNA，采用反转录试剂盒将提取到的总RNA进行RNA逆转录，合成cDNA。具体实验步骤严格参照Trizol试剂盒说明书。采用qRT-PCR法检测目的基因mRNA的表达水平，具体实验步骤严格参照试剂盒说明书进行。实验重复3次。

4.细胞培养：采用含10%胎牛血清的培养基在37 ℃，5%CO2的培养箱中常规培养Treg细胞，待细胞融合度≥80%时，用2.5%的胰蛋白酶每2天进行消化，传代，并取对数生长期细胞用于实验。

5.细胞转染：取对数生长期的Treg细胞，接种于6孔板中，每孔接种1.5×106个，并置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养至细胞融合度为60%～70%时进行转染。将Treg细胞分为2组：Ncontrol的miRNA对照转染组以及miR-182过表达miRNA转染组，并将培养基换成每孔1 ml无血清无双抗的培养基，miRNA及转染试剂Lipofectamine 2000分别用100 μl OMEM稀释后，依照公司说明书所需比例混匀后静置20 min后，逐滴加入并且轻晃混匀，培养6 h后，再换为含完全培养基，待48 h后收集细胞进行下一步分析。

6.荧光素酶报告基因法检测：通过microRNA靶基因数据库预测到miR-182与HES1的3’-UTR存在结合位点。为了验证miR-182与HES1是否存在靶向关系，构建野生型HES1的3’-UTR荧光素酶报告基因质粒pMIR-HES1-wt，并以pMIR-HES1-wt质粒为模板，利用PCR搭桥法(overlapping PCR)构建其潜在结合位点突变型报告基因质粒pMIR-HES1-Mut。将miR-182 mimics，negative control miRNA mimics (miR-NC)，内参海肾荧光素酶以及pMIR-HES1-wt和pMIR-HES1-Mut报告基因质粒共转染进HCAEC细胞中，于37 ℃，5% CO2的细胞培养箱中培养36 h后收取细胞，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定三组细胞的荧光素酶活性。具体操作步骤严格参照试剂盒说明书。实验共重复3次。

7. Western Blot：采用含50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)，150 mmol/L NaCl，0.5%脱氧胆酸钠，0.1% SDS和蛋白酶抑制剂及1 mmol/L苯甲基磺酰氟的RIPA裂解液分离蛋白质。通过SDS-PAGE凝胶进行电泳，按说明书进行Western Blot实验。

结 果

一、KD患儿的临床资料及miR-182在KD临床特征的相关性

我们通过血液常规检测KD各组的临床研究数据，结果显示，除各组研究对象年龄无统计学意义(P>0.05)，其他各组数据相比都具有显著性差异(P<0.05)，说明本次实验对象分组是有可比性的，有研究价值(表1)。我们进一步通过检测血清miR-182表达水平与KD患儿临床特征的相关性，结果发现miR-182在血小板计数大于300×109/L的KD急性组血清中的表达水平显著高于正常对照组(P<0.05)，而其他各组数据指标上并无显著性差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。结果提示，急性KD血清中miR-182表达量相对较高，这种异常现象可能是参与KD病理进程，miR-182对急性KD具有调控功能。

表1 血液检测KD各组的临床数据

表2 检测血清miR-182表达水平与KD临床特征相关性

二、流式细胞法检测各组外周血中Treg细胞比例

流式细胞仪检测结果显示：KD急性组外周血中Treg细胞比例为(4.4±1.4)%，明显低于KD治愈组和正常对照组的(9.0±2.0)%、(10.2±2.8)%，差异有统计学意义(P<0.05)表3。

三、外周血中目的基因qRT-PCR检测结果

1.外周血mRNA表达水平的比较:qRT-PCR检测结果显示：KD急性组中( Foxp3, Notch1,Notch3,Jagged1,HES1) mRNA 的表达水平低于KD治愈组和正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；而KD急性组中Jagged2 mRNA表达水平与正常对照和KD治愈组比较，差异无统计学意义(P>0.05)表4。

GroupnTreg cell fraction(%)Acute214.4±1.4Cure149.0±2.0Normal control1610.2±2.8

表4 外周血中外周血中mRNA 表达水平的比较

2.TGF-βmRNA表达水平的比较:qRT-PCR检测结果显示：KD治愈组与正常对照组外周血中TGF-β mRNA表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；KD急性组外周血中TGF-β mRNA表达水平明显低于正常对照组和KD治愈组，差异有统计学意义(P<0.01)(图1)。

3. TGF-βRI、TGF-βRII、Smad3、Smad4 mRNA表达水平的比较:qRT-PCR检测结果显示：KD急性组TGF-βRI、TGF-βRII、Smad3、Smad4 mRNA的表达水平均明显低于正常对照组与KD治愈组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2。

四、 miR-182与靶基因HES1的关系

双荧光素酶检测结果显示：miR-182 mimics可以抑制pMIR-HES1-wt质粒荧光素酶活性；而对pMIR-HES1-Mut荧光素酶活性无明显影响(图3)。

五、miR-182与靶基因HES1的调控作用

为进一步验证miR-182对HES1的调控作用，通过qRT-PCR检测发现，miR-182 mimics转染组中HES1 mRNA表达水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；并且Western blot检测结果显示：miR-182 mimics转染组中HES1蛋白表达水平低于对照组，差异也有统计学意义(P<0.05)。表明miR-182能够抑制HES1的mRNA翻译及其蛋白表达(图4)。

Note: **compared with the normal control group(NC), P<0.01图1 各组外周血中TGF-β mRNA的表达水平Figure 1 Expression levels of TGF- mRNA in peripheral blood by KD group

Note: **compared with the normal control group(NC), P<0.01图2 各组外周血中TGF-βRI、TGF-βRII、Smad3、Smad4 mRNA的表达水平Figure 2 Expression levels of TGF- RI mRNA, TGF- RII mRNA, Smad3 mRNA and Smad4 mRNAby groupThe expression levels of A.TGF- RI mRNA, B.TGF-RIImRNA, C.Smad3mRNA,D. Smad4 mRNA were detected by qRT-PCR** compared with the normal control group, P<0.01

Note: B ** compared with the normal control group, P<0.01图3 miR-182与靶基因HES1的相关性Figure 3 The correlation between miR-182 and the target gene HES11.the binding site of mir-182 to the target gene，B.luciferase activity was detected by luciferase reporter gene assay ** compared with the normal control group, P<0.01

图4 miR-182与靶基因HES1 mRNA表达水平及蛋白含量的关系Figure 4 Expression and protein content of miR-182 and the target gene HES1 mRNAA.the expression level of HES1 mRNA in miR-182 was detected by qRT-PCR,B.the protein expression level of HES1was detected by Western blot

六、HES1激活Notch及TGF-β信号通路

Western blot检测结果显示在HES1处理组中Notch及TGF-β途径受体Notch1、Notch3、TGF-βRI、TGF-βRII、Smad3、Smad4的磷酸化蛋白表达水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，而在加入抑制剂后，在DAPT+HES1处理组中则显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。结果提示HES1激活了Notch及TGF-β信号通路，诱导了途径受体表达升高。

图5 HES1激活Notch及TGF-β信号通路Figure 5 HES1 activated Notch and TGF- signaling pathways

讨 论

川崎病是儿童常见的一种自身免疫性血管炎综合征，其主要累及患儿心脏的冠状动脉，可导致冠状动脉扩张、冠状动脉狭窄及冠状动脉瘤，严重时可导致患儿心肌梗死。目前，KD已成为儿童成年后心脏疾病和冠状动脉损伤的重要原因之一。

Treg细胞是维持机体自身耐受，负向调节免疫反应的关键因素。Foxp3主要表达于Treg细胞，是Treg细胞的主要标志物，也是Treg细胞发育、功能特异性的主要调节因素之一。本研究结果显示，KD急性组外周血中Treg细胞比例、Foxp3 mRNA表达水平均低于正常对照组和KD治愈组。急性KD患儿外周血中Treg细胞减少，与KD的病理进程有关系，而Foxp3的低表达可能是Treg细胞减少的重要原因，可能在急性川崎病的病理进程中发挥调节作用[6]。

相关研究表明，TGF-β单独存在时可以上调初始T细胞中Foxp3的表达，促进初始T细胞分化为Treg细胞[7]。本研究结果显示，KD急性组TGF-β mRNA的表达水平低于正常对照组和KD治愈组。结果提示，TGF-β的低表达可能与Foxp3异常表达有关，是导致Treg细胞减少的重要原因。TGF-β与其受体Ⅱ结合形成杂合四聚体复合物，激活TGF-β信号通路。TGF-β Ⅱ型受体激活时，可使TGF-β Ⅰ型受体富含甘氨酸、丝氨酸的区域磷酸化，进而磷酸化Smad3蛋白。Smad3磷酸化后与受体/SARA复合物脱离，与Smad4形成低聚复合物。低聚复合物可以易位至细胞核，与Foxp3启动子富含GC序列的区域相互作用，诱导Foxp3表达。本研究结果显示，KD急性组TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad3、Smad4 mRNA的表达水平均低于正常对照组与KD治愈组(P<0.05)，表明Smad蛋白信号途径的低表达可能是急性KD Foxp3表达水平下降的直接原因。

相关研究表明，TGF-β和Notch信号途径间存在对话通路，Notch信号途径与Treg细胞分化有关，Notch1是TGF-β1介导Treg细胞免疫抑制的关键因子[8]。HES1可能是Notch和TGF-β信号途径的直接靶基因，TGF-β信号途径中释放的磷酸化Smad3蛋白与Notch信号途径中释放的Notch1受体胞内结合域结合，可以促进磷酸化Smad3蛋白的核易位。当TGF-β信号途径的表达受影响时，相关下游分子和Notch信号途径的表达均受到影响，从而导致Foxp3表达下调。Notch的配体Jagged也可以调控Treg细胞，Jagged1过表达可以诱导抑制性CD4+T细胞的分化，Jagged2可以通过Notch途径推动Treg细胞分化[9]。本研究结果显示，KD急性组Notch1、Notch3、Jagged1、HES1 mRNA的表达水平低于KD治愈组和正常对照组(P<0.05)，而Jagged2 mRNA的表达水平与KD治愈组和正常对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。然后我们用Western blot检测结果显示在HES1处理组中Notch及TGF-β途径受体Notch1、Notch3、TGF-βRI、TGF-βRII、Smad3、Smad4的磷酸化蛋白表达水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，而在DAPT+HES1处理组中显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。结果说明，靶基因HES1低表达和Notch信号异常有关，Notch信号途径异常可能与Treg细胞减少也有关，而HES1激活了Notch及TGF-β信号通路，诱导了途径受体表达升高。

miRNA参与了细胞的代谢、增殖、分化及凋亡等过程，可以广泛调节机体的生理、病理过程，与肿瘤、心血管疾病、遗传性疾病等的发生发展有关。miRNA在致病机理的研究、疾病的诊断和治疗方面的重要性越来越受到人们的关注[10]。本研究检测血清miR-182表达水平与KD患儿临床特征的相关性，结果发现miR-182在血小板计数>300×109/L的急性期KD患儿血清中的表达水平低于血小板计数≤300×109/L的急性期KD患儿(P<0.05)，结果提示，急性川崎病(KD)血清中miR-182表达量相对较低，这种异常现象可能是其参与KD病理进程，对KD具有调控功能。通过microRNA靶基因数据库进行筛选，预测HES1为miR-182的潜在靶基因，构建了HES1野生型3’-UTR荧光素酶报告基因质粒pMIR-HES1-wt及突变型报告基因质粒pMIR-HES1-Mut。将miR-182 mimics，negative control miRNA mimics (miR-NC)，内参海肾荧光素酶以及pMIR-HES1-wt和pMIR-HES1-Mut报告基因质粒共转染进HCAEC细胞中，双荧光素酶检测结果显示，miR-182 mimics可显著抑制pMIR-HES1-wt质粒荧光素酶活性；而对pMIR-HES1-Mut荧光素酶活性无明显影响。结果表明miR-182可以通过结合HES1的3’-UTR进而抑制HES1的表达。为进一步验证miR-182对HES1的调控作用，通过qRT-PCR检测发现，miR-182 mimics转染组中HES1的mRNA表达水平显著低于对照组，并且Western blot检测结果显示，相比对照组，miR-182 mimics转染组中HES1蛋白表达水平显著降低。上述结果表明miR-182能够抑制HES1的mRNA翻译及其蛋白表达。

综上所述，miR-182可以通过下调HES1的表达抑制Notch与TGF-β信号途径，可能导致Treg细胞减少，miR-182与HES1的靶向调控可能会成为急性川崎病检测与治疗医学的新靶点。