胎膜细胞焦亡与胎膜早破的相关性研究

肖文霞 王会芝 周广杰 栾艳秋

胎膜早破是指临产前胎膜自然破裂，是产科常见的并发症。根据发生的孕周不同，可分为未足月胎膜早破和足月后胎膜早破。胎膜早破可引起绒毛膜羊膜炎、子宫内膜炎、胎儿窘迫、脐带脱垂、早产及新生儿呼吸窘迫综合征等，围产儿病死率较无胎膜早破者明显增高，胎膜早破仍是当今产科临床最棘手的问题之一。胎膜早破对母儿威胁大，因此，积极寻找胎膜早破的病因，减少胎膜早破的发生，对于减少母婴并发症，改善母儿围产期结局具有重要意义。然而胎膜早破的确切病因尚未完全明确，目前国内外学者主要从感染、宫腔内压力异常、营养、社会心理因素等宏观方面以及基因、凋亡和神经内分泌等微观方面进行研究。本研究旨在测定胎膜组织中细胞焦亡指标caspase-1和IL-1β的水平，探讨细胞焦亡与胎膜早破的关系，寻找胎膜早破的病因及发病机制，为临床预防和治疗胎膜早破提供理论依据。

资料与方法

1.研究对象：选取2016年10月—2018年1月间本院产科病房孕妇80例，分为三组：未足月胎膜早破组孕妇20例，足月胎膜早破组孕妇30例，正常足月组孕妇30例为对照。未足月胎膜早破组年龄20～44岁，平均年龄为(27.1±0.3)岁，孕周为孕28～36+6周，平均孕周为(34.2±1.2)周；足月胎膜早破组年龄22～44岁,平均年龄为(29.3±1.4)岁，孕周为孕37～41周，平均孕周为(39.2±1.2)周；正常足月组年龄22～42岁,平均年龄为(30.1±0.8)岁，孕周为孕37～41周，平均孕周为(39.6±0.5)周。三组均为单胎孕妇，无其它妊娠并发症及内外科合并症，无宫内感染及其它临床发热征象。胎膜早破诊断标准：临产前孕妇感觉阴道内有尿样液体流出；窥器打开时，可见液体自宫颈流出或后穹隆较多积液，并见到胎脂样物质；阴道液PH测定：PH≥6.5；阴道液涂片可见羊齿植物状结晶(8版《妇产科学》)。该研究由本院伦理委员会批准。

2. 标本制备：于剖宫产或阴道分娩后，取胎膜组织约1.0～2.0 g，以冷生理盐水漂洗至内含血块洗净，吸干，称重，置于-20℃冰箱备用。

3. 实验步骤：(1)将已称重的胎膜组织加9倍的生理盐水，倒入放置于冰块中的玻璃管内，匀浆，以3000 r/min离心15 min，取上清液分装待测。(2)用ELISA法检测胎膜组织中caspase-1和IL-1β的水平，测量的步骤严格按照说明书进行。

结果

胎膜早破组与正常足月组妇女胎膜组织中的caspase-1和IL-1β含量比较：未足月胎膜早破组和足月胎膜早破组与正常组相比，胎膜组织中的caspase-1和IL-1β均明显升高，差异有统计意义；与足月胎膜早破组相比，未足月胎膜早破组的caspase-1和IL-1β含量均明显升高，差异有统计学意义。见表1。

表1 三组妇女血清中caspase-1和IL-1β测定结果

注：与正常足月组相比，*P<0.05；与足月胎膜早破组相比，△P<0.05

讨论

1.细胞焦亡

细胞焦亡(pyroptosis)是炎症性程序性细胞死亡，是程序性细胞死亡的一种形式，以细胞膜破裂并释放出炎性内容物为特征。形态学上，细胞焦亡含有凋亡和坏死的特征，但又区别于凋亡和坏死。“细胞焦亡”这一术语最早由华盛顿大学学者Cookson等在2001年首次提出[1]，pyroptosis一词来源于希腊语前缀“pyro-”意思为“火或热”，另一希腊语单词“ptosis”，意思为“降落”，意在反映细胞焦亡的炎性特征，并阐明其不同于其他形式的程序性细胞死亡[2]。

细胞焦亡作为一种炎性细胞死亡形式，是机体在应对病原体感染或危险信号刺激时所做出的一种反应[3]。当机体受到病原体感染或危险信号刺激时，模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs) 可识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)或损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)，启动机体的固有免疫和(或)获得性免疫。PRRs家族包含许多成员，包括Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体(nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat containing receptors，NLRs)、黑素瘤缺乏因子样受体(absent in melanoma like receptors,AIMs)和C形凝集素等[4]。在这些识别分子中，进化过程中保守的 NLRs 和AIMs能够组成一个多聚体的蛋白复合物称为炎性小体。典型的炎性小体由识别分子、接头蛋白ASC(凋亡相关斑点样蛋白,an apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD domain,ASC)及caspase-1(半胱氨酸蛋白酶-1)前体组成。一旦受到感染或危险信号刺激，识别分子激活并与ASC相互作用，并寡聚在一起，ASC通过它的caspase激活和招募结构域(a caspase recruitment and activation domain，CARD)和caspase-1前体相互作用而招募caspase-1前体，从而形成多蛋白复合物炎性小体[5]。这种复合物的形成触发了caspase-1前体自我催化切割，形成具有活性的P10/P20四聚体，成为活性 caspase-1。激活的 caspase-1可促进炎性细胞因子IL-1ß(白介素-1 ß)和IL-18(白介素-18)从未成熟的前体形式转化成为活性形式；激活的 caspase-1也能引起细胞焦亡[6]。这种由炎症小体启动的细胞焦亡称为经典的细胞焦亡途径[7]。

除了经典的启动途径外，还有另外一种细胞焦亡启动途径——非经典途径。在非经典途径中，鼠类的 caspase-11(人类caspase-4/5)直接与胞浆中LPS(脂多糖)相锚定，不需要炎性小体而直接导致细胞焦亡。鼠caspase-11(人类caspase-4/5)不能切割 IL-1ß和IL-18前体而形成活性形式，这些 caspase可以促进炎性小体的组装，从而激活caspase-1，间接诱导 IL-1ß和IL-18前体的成熟[8]。因此 caspase-1激活是两种途径中的关键[9]。

最近研究表明：孔形成蛋白(gasdermin D，GSDMD)是细胞焦亡的执行者，是caspase-1和 caspase-11/4/5的底物，可被活性caspase-1/11/4/5切割[10]。GSDMD可被上述激活的caspase切割成31KD的N末端(GSDMDNterm)和22KD的C末端(GSDMDcterm)片段，GSDMDNterm可锚定细胞膜上的脂质及其他成份，组装成弧形、裂缝形及环形的寡聚体，每个寡聚体都可形成穿透膜的小孔[11]。这些小孔直径大约为10～15 nm。细胞膜上小孔的形成可使促炎性细胞因子IL-1ß和IL-18释放到细胞外，引起炎症；同时阳离子特别是Ca2+内流，破坏了细胞的渗透压和电化学梯度，紧接着水分内流，增加了细胞的压力，导致细胞肿胀和溶解，因此，细胞焦亡又被重新定义为“gasdermin依赖型细胞死亡”[12]。caspase-1 、IL-1ß和IL-18是目前得到广泛认可的研究细胞焦亡的指标[13]。

2. 细胞焦亡与胎膜早破

本研究结果显示：与正常对照组相比，无论未足月还是足月胎膜早破组的胎膜组织中的caspase-1和IL-1β含量均明显升高，差异有统计意义，这说明胎膜组织中存在着细胞焦亡现象。已知胎膜由羊膜及绒毛膜组成。羊膜是胎膜的最重要结构，有两种细胞组成：表面的上皮细胞和下层的间质细胞。间质细胞可产生间质胶原(I、III、V型)以保持羊膜的完整性[14]。因此胎膜从大体结构上可分为胎膜细胞和胶原组成的细胞外基质。胎膜破裂可以是由胎膜细胞坏死、脱落而引起；也可由于细胞外基质降解，使细胞之间的连接破坏而引起，也可由二者同时起作用而引起。有研究表明：IL-1ß可引起细胞MMPs(基质金属蛋白酶)表达增多[15]，而MMPs可通过调节胎膜组织的细胞外基质蛋白代谢，从而降解细胞外基质胶原而引起胎膜破裂[16-17]。因而本研究推测胎膜早破可能是由于胎膜细胞在受到病原体感染或危险信号刺激下，启动经典或(和)非经典细胞焦亡途径，激活caspase-1，促进IL-1ß成熟，并作用于底物GSDMD，形成穿透膜的小孔，导致胎膜细胞肿胀和溶解，引起胎膜破裂；也可能由于大量释放出细胞外的炎性细胞因子IL-1β刺激MMPs，导致细胞外基质降解而引起；也可能是上述因素同时作用的结果。

本研究结果还显示：与足月胎膜早破相比，未足月胎膜早破组caspase-1和IL-1β均明显升高，差异有统计意义，这说明未足月胎膜早破中有更强的细胞焦亡。有研究表明：随着孕周增加，胎膜中维持张力的主要组成部分——羊膜，经历了胶原重塑；在孕晚期也可出现羊膜细胞凋亡。由于胶原重塑和细胞凋亡，胎膜在孕晚期变得更加薄弱，更容易破裂，以准备在临产时破裂[18]。因此孕中期胎膜组织比孕足月胎膜组织更具有张力，需要更高水平的细胞焦亡才会使胎膜发生破裂。

综上所述，细胞焦亡与胎膜早破具有相关性。细胞焦亡是近年来生命科学的研究热点，对其分子机制的研究越来越深入。因此，研究细胞焦亡的瀑布级联反应，寻找级联反应中的靶点，有望成为预防与治疗胎膜早破的新途径。关于细胞焦亡与胎膜早破的研究仍待进一步进行。