河南省某蛋鸡场新城疫病毒ZK1/18毒株的分离鉴定

贾松涛，刘 炜，周婷婷，张 军

（郑州市动物疫病预防控制中心，河南郑州 450052）

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一种急性高度接触性传染病，是世界动物卫生组织（OIE）规定的须通报禽病之一，我国将其列为一类动物传染疫病[1]。禽感染NDV的临床特征主要是呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜浆膜出血。鸡、珠鸡、火鸡及野鸭都对NDV易感，其中鸡最易感。NDV的RNA核苷酸序列长约15 kb，整个基因组包含6个主要的ORF，即3'-NP-PM-F-HN-L-5'，F基因ORF全长1 662 bp，编码553个氨基酸[2]。F蛋白（融合蛋白）是一种糖基化蛋白，位于囊膜表面的小纤突，介导病毒囊膜与宿主细胞膜的融合，促进病毒侵袭。F蛋白裂解位点的氨基酸序列组成是该病毒毒力的分子基础[3]。国家新城疫参考实验室自2002年成立后，已在全国各地分离到具有代表性的NDV 300多株，并建立了病毒库及各毒株详细的基因库。该实验室研究发现，基因VII型是目前在我国流行的优势基因型，所占比重逐年上升[4]，同时III、IX、VI等其他基因型也在散发流行[5-7]。

2018年3月，河南省一存栏6 000只150日龄蛋鸡发生以产蛋下降及呼吸道症状为主要特征的疾病，发病率为10.0%，死亡率为1.2%。该场病鸡临床症状主要表现为：精神沉郁、咳嗽、呼吸困难，并不时发出喘鸣声，拉黄绿色稀便；产蛋率下降，产畸形蛋、沙壳蛋、软壳蛋。剖检可见：呼吸道黏液增多并且轻微出血，腺胃乳头出现针尖状出血点；肠道剖检病变集中，小肠黏膜出现弥漫性出血。通过临床症状和剖检病变，初步诊断为ND。该场ND免疫程序为35、80日龄“新流二联”肌内注射0.5 mL/只，145日龄“新支减”肌内注射0.5 mL/只。各疫苗中ND抗原成分所用毒株均为NDV La Sota株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 无菌采集病死鸡的喉头/气管、肺脏、脾脏、肝脏、肾脏及心脏等组织。

1.1.2 试验材料 抗NDV阴性、阳性血清：购自中国兽医药品监察所；SPF鸡胚：购自乾元浩生物股份有限公司郑州生物药厂；Trizol LS、AMV：购自Promega公司；DH5α感受态、Ex Taq预混酶、DNA片段快速纯化回收试剂盒、pMD19-T载体：购自大连宝生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒分离 采集适量病死鸡的心脏、肝脏及气管等组织，加入2 mL PBS液混合研磨，离心后取上清液反复冻融3次，再离心取上清，接种3枚9日龄鸡胚，每枚接种0.2 mL，石蜡封口，37 ℃孵育4 d；每隔8 h照胚，弃去24 h内死亡胚，收集24～96 h的死胚、濒死胚，同时收取对照正常存活鸡胚，置于4 ℃冰箱过夜；无菌抽取尿囊液，每管1.5 mL，分装后放于-20 ℃冰箱备用。盲传3代，测定HA效价。

1.2.2 血清学鉴定 将分离毒株进行HA及HI测定，按国家标准《新城疫诊断技术》（GB/T 16550—2008）进行操作。

1.2.3F基因RT-PCR扩增、克隆与鉴定 为扩增F基因全部序列，对HN基因的部分上游片段、F基因全片段以及M基因的部分下游片段进行引物设计。根据GenBank公布的F48E9株全基因序列（序列号MG 456905.1），设计1对引物，合成片段总长预计为1 932 bp。引物由上海生工生物工程技术有限公司合成（NDV-F1：5'-GCT CGG ACC CTC TGT GCT TGT G-3'；NDV-F2：5'-GGT TGC TTG TTC CCA GTA GTT T-3'）。采用西安天隆全自动核酸提取仪提取病毒RNA。PCR反应条件为，95 ℃ 5 min，94 ℃ 60 s，56 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，40个循环；72 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min。扩增完成后用1%琼脂糖凝胶电泳，回收特异DNA条带，进行DH5感受态细胞转化，按说明书提取质粒，分别作质粒PCR及酶切鉴定。将PCR 阳性质粒送上海生工有限公司测序，运用DNAstar、Primer软件分析序列并构建基因进化树。

2 结果与分析

2.1 病毒分离及血清学鉴定

盲传3代后，鸡胚在45～65 h内全部死亡，胚体全身充血、水肿，尤其以头部出血最为明显。无菌收集尿囊液测HA效价，结果均在1:64～1:256之间；将分离毒株配成4单位抗原，用NDV标准阳性血清、AI（H5、H7、H9亚型）阳性血清测其HI效价。NDV标准阳性血清HI效价为1:1 024，AI（H5、H7、H9亚型）标准阳性血清HI效价分别为0、1:4、1:2，表明所分离毒株为NDV，命名为A/Chicken/China/zhoukou1/18，简称ZK1/18（表1）。

表1 病毒的传代培养及HI试验结果

2.2 F基因扩增与酶切鉴定

酶切后出现了2.0 kb和3.0 kb左右的条带，与预期目的基因片段（1 932 bp）及T载体片段大小相符，说明重组质粒中已经成功连接了所扩增的F基因片段（图1）。

图1 目的基因酶切鉴定及RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳图

2.3 F基因序列分析和基因进化树构建

测序结果表明，所扩增分离株基因全长1 932 bp，包含F基因ORF全长，与预期片段大小相符。应用DNAstar软件推导其氨基酸序列，发现其F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112R-RQ-K-R-F117，与NDV强毒株的分子特征相符[2]。将所测病毒分离株的F基因序列与国内外已发表的其他NDV片段进行序列比对，构建包含23株NDVF基因的遗传进化树（图2）。

图2 ZK1/18株NDV F基因系统进化树

对F基因进行同源性分析发现，该毒株与国内标准毒株F48E9及疫苗株La Sota之间的核苷酸亲缘关系都相对较远，其同源性分别为85.9%、83.5%，而与新疆CJG-xinjiang- 07株同源性为99.6%，与山西株、河南株、辽宁株、宁夏株等同源性在95%～976%之间，属于VII型，与国外分离毒株的亲缘关系相对较远（图3），说明国内的NDV流行趋势在地域上逐渐趋于统一。

3 讨论

NDV为有囊膜的负链 RNA病毒，基因组全长有3种：15 186 bp、15 192 bp和15 198 bp。我国近年流行的NDV毒株除了经典的基因VI型外，还出现了我国独有的变异基因IX型[8]。秦卓明等[9]研究发现：历史上发生的4次ND大流行都出现了不同的基因型，并且每次流行均以新基因型为主；NDV毒株的基因型进化在全世界不同地区存在不同程度的同步现象；20世纪90年代的ND大流行主要由基因VII型引起[10]。

本次分离的新城疫病毒属于基因VII型，该基因型在我国大陆地区首次报道于2000年[11]。研究发现，大陆VIId亚型NDV源于我国台湾地区的TW98/4株，后相继演变为Ch97/1、Ch98/3、Ch/99、Ch/2000等VIId亚型，是造成我国大陆地区1998—2000年ND暴发的代表毒株[12]。ZK1/18分离株与新疆、西藏、山西、河北、浙江等地分离的NDV毒株同属于VII型，进而推断VII型在河南省仍是引起ND疫情的主导基因型。

本次新城疫疫情发生的原因可能有两个方面：一方面鸡群处于产蛋初期，机体本身有一定的应激反应，加之春季气候不稳定，养殖户疏于管理，冷空气侵袭时造成鸡群抵抗力降低；另一方面由于鸡群免疫程序中使用的疫苗株La Sota株属于基因II型，对基因VII型野毒的侵袭可能不会完全抵御。因此，广大养殖户做好禽群免疫和饲养管理的同时，要结合气候变化，适时通风，做好场区和鸡舍消毒工作。

图3 ZK1/18株与其他毒株F基因同源性分析