福建省南美白对虾幼体急性肝胰腺坏死病病原分离与PCR检测

郭书林，陈信忠，尤颖哲，陈何东，王艺红，丁亦男，龚艳清，杨俊萍

（1.厦门海关，福建厦门 361016；2.漳州市水产技术推广站，福建漳州 363000）

近年来新出现的对虾传染病常造成大批对虾发病死亡，给全球对虾养殖业带来巨大经济损失，其中最主要的疫病为急性肝胰腺坏死综合征（acute hepatopancreas necrosis syndrome，AHPNS）[1]。该病主要发生于虾苗放养后7～30 d，亦称为早期死亡综合征（early mortality syndrome，EMS）。该病从发生至今的10年间，给全球三大对虾生产国——泰国、中国和越南的对虾养殖业造成30%～40%左右的减产[2]，给我国海南、广东、福建、广西等省份的养殖场造成了严重影响。为此，世界动物卫生组织（OIE）将其列入须通报水生动物疫病名录。2013年5月，国际水产联盟（GAA）和联合国粮农组织（FAO）先后宣布，导致AHPNS的病原体是副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus，VP）的特异变种。本研究利用泰国专家Flegel等[3]报道的PCR检测方法，对福建省多家规模化南美白对虾养殖场进行了AHPNS检测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 采集福建省9家规模化南美白对虾苗种繁育基地的患病对虾幼体各10只，共获得90份样本。VP分离纯化用培养基：青岛海博公司产品；PCR mix反应液：天根生物科技有限公司产品；PCR引物：上海生工科技有限公司合成。

1.1.2 主要仪器设备 PCR扩增仪：美国ABI公司生产；VITEK-2全自动细菌鉴定系统：法国生物梅里埃公司生产。

1.2 方法

1.2.1 样品处理 取南美白对虾幼体肝胰腺，按国家标准GB 4789.7—2013中的副溶血性弧菌分离纯化鉴定方法，将得到的VP菌株作为PCR检测用模板。

1.2.2 PCR检测 PCR检测通过引物AP3F：5'-ATGAGTAACAATATAAAACATGAAAC-3'（SEQ ID NO:1） 和 AP3R：5'-GTGGTAATAGATTGTACAGAA-3'（SEQ ID NO:2）扩增质粒pVA1的基因片段（以纯化的VP作为模版），目的片段大小为336 bp。PCR产物经测序、Blast比对后，确定分离所得的VP是否为携带质粒pVA1的特异性VP菌株。反应体系为：10×PCR buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，AP3上下游引物各（10 μmol/L）1 μL，dNTP（10 mmol/L）2 μL，TaqDNA 聚合酶 0.5 μL，抽提物 5 μL，加水补至 25 μL。按照以下程序进行扩增：94 ℃5 min，然后进行32次循环（94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s），72 ℃ 5 min，4 ℃ 保温。

1.2.3 不同样本处理方式对检测结果的影响分析取肝胰腺，按DNA抽提试剂盒说明书提取DNA样本，并以此作为PCR检测模板；取肝胰腺，按1:10 的比例放入含1.5% NaCl的 TSB培养基中，30 ℃，250 r/min，振荡培养 5～6 h。荡结束后，取菌液放入1.5 mL离心管中，3 000 r/min，离心5 min，弃上清，加PBS 悬浮，将增菌后的增菌液作为PCR检测用DNA模板。将上述2种处理方式的检测结果进行比较，分析不同样本处理方式对检测结果的影响。

2 结果

2.1 VP分离和PCR检测

从9家规模化南美白对虾养殖场分别取10只患病幼虾，共获得90份样本，增菌后从其中33份样本的弧菌显色培养基平板上分离到疑似VP。挑取其中5个单菌落进行确认，发现氧化酶阳性，革兰氏染色阴性，且VITEK-2全自动细菌鉴定系统确认为VP。鉴定确认的VP菌株分别来自于27份样本，共81株（表1）。

对81株VP进行PCR检测，检出阳性菌株72株，PCR电泳结果见图1。阳性菌株分别来自23份样本，其中16份样本的所有受检VP菌株均为特异性菌株，6份样本的部分受检VP为特异性菌株，1份样本的所有受检VP均非特异性菌株，说明患病幼虾肝胰腺存在不同基因型VP同时感染情况。

表1 VP分离和PCR检测结果 单位：株/份

图1 AP3引物扩增PCR产物电泳分析

2.2 以肝胰腺DNA进行PCR检测

90份样本中，8份样本的PCR检测结果为阳性，包含于2.1结果中的22份PCR检测特异性VP阳性样本中，说明直接以肝胰腺DNA进行PCR检测的方法灵敏性较低，较之于2.1方法的检出率降低了约63%。

2.3 以肝胰腺增菌液进行PCR检测

90份样本中的25份样本检测结果为PCR阳性，其中22份样本与2.1的检测结果相吻合，而另3份样本在2.1方法中的检测结果为VP分离阳性而PCR阴性。两种方法的检测结果略有差距。

3 讨论

2014年，有关AHPNS的病原学研究取得了重要进展，通过比较VP致病株与非致病株的基因序列，发现了与致病性相关的pVA1质体，并证明致病性VP的毒素蛋白PirA和PirB是引起AHPNS的关键。Flegel等[3]公布了一种通过引物AP3检测急性肝胰腺坏死病（AHPND）VP分离株的新方法。该方法基于一种12 kDa蛋白质的基因序列，AP3引物优于之前公布的AP2引物，与先前推荐的100%敏感性、97.7%特异性、97.4%阳性预测值和100%阴性预测值相比，新方法具有100%的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值。Flegel等认为，AP3扩增法对细菌分离株的DNA提取液具有足够的敏感性，不建议将此方法应用于嵌套的PCR。但是，对于来自虾组织、小虾或幼虾粪便、整个幼体和其他疑似携带者以及来自池塘沉积物等环境源样品，建议在含有1.5% NaCl补充物的TSB中进行初步富集，在30 ℃左右的温度下振荡培养4 h。此后，让所有碎片沉淀，然后将混浊的上清液离心，收集细菌，丢弃上清液。从细菌颗粒中提取DNA，并使用大约100 ng的模板进行PCR测试。本试验中，以从幼虾肝胰腺中分离到的VP为DNA模板进行PCR检测的灵敏性高，直接以幼虾的肝胰腺为DNA模板进行PCR检测的灵敏性较低，检出率降低了63%。以肝胰腺增菌液进行PCR检测，检出3份阳性样本，但经VP分离后再进行PCR检测的结果为阴性，推测可能PCR检测试验中未挑取到AHPNS阳性VP，造成了漏检。另一种可能是以肝胰腺增菌液进行的检测出现了假阳性；或者虾体曾经感染过AHPNS阳性VP，目前仅携带其DNA，而未携带VP活菌。因本试验未进行回归感染试验，所以无法验证以肝胰腺增菌液进行的PCR检测与VP法的PCR检测结果差异是否由假阳性导致。

将本试验的VP PCR检测结果与张娜等[4]的结果进行比较，发现该方法具有很好的检出率和灵敏性，推测原因可能是对虾样本的选择不同导致。本试验中，对虾样本为患病幼虾，而张娜的试验对象是随机采取的亲虾，而患病幼虾肝胰腺中AHPNS阳性VP丰度可能较高，使得AHPNS阳性VP的检出率显著提高。

本试验对福建省9家规模化对虾养殖场的90份患病幼虾样本进行AHPNS检测，从27份样本中分离鉴定出81株VP，其中从22份样本中分离到AHPNS阳性VP，显示发病养殖场具有较高的VP感染风险和AHPNS暴发风险。