淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒实时荧光RPA快速检测方法的建立

熊 炜，陈鸿军，魏晓锋，王 艳，胡建华，黄忠荣

（1.上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心，上海 200135；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；3.上海实验动物研究中心，上海 201203）

由淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV）引起的淋巴细胞脉络丛脑膜炎，是一种啮齿类动物多发的急性人兽共患病，临床表现为流行性感冒、脑膜炎、脑炎等症状[1-2]。LCMV的主要宿主是家鼠和仓鼠等啮齿类动物，但犬、猫、猴等动物和人类也可感染[3-5]。1989年美国一家癌症研究所报道，实验人员在不知试验用祼鼠感染LCMV的情况下，使用该裸鼠进行肿瘤移植手术而使人感染LCMV[6]。人感染LCMV的主要途径是直接接触带毒动物的排泄物或分泌物。成年人感染LCMV 8 ～13 d后出现临床症状，典型表现为发热、头痛、肌肉痛、呕吐等类似流感样症状，偶有单侧睾丸痛、“妄言”等症状，严重者表现为脑膜炎、听力下降，还有约三分之一的患者没有临床症状[7-8]。目前检测LCMV的方法主要有血清中和、免疫荧光、免疫组化、ELISA、RT-PCR和荧光RT-PCR等[9-11]。鉴于LCMV隐性感染的特征及人兽共患的危害性，为加强入境野生和实验用啮齿类动物的LCMV筛查和流行病学调查，本研究建立了LCMV实时荧光RPA快速检测方法，并通过与RT-PCR方法对比，评估了其特异性、敏感性和稳定性。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

TRIzol：购自Invitrogen公司；Taq酶、AMV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP、随机引物、DNA Marker（DL 2 000 bp）：购自Takara公司；RPA检测试剂：购自英国TwistDx Inc公司；DNA抽提试剂盒（QIAamp DNA Blood Mini Kits）：购自QIAGEN公司；磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）：购自Gibico公司；其他试剂：购自国药集团上海化学试剂有限公司。

1.2 病毒样品来源及处理 LCMV阳性组织样品、血清和细胞培养物为本室保存。阳性组织样品加等体积生理盐水研磨匀浆，3 000g离心15 min，收集上清液待检。本研究使用的其他病毒，如小鼠肝炎病毒（mouse hepatitis virus，MHV）、小鼠肺炎病毒（pneumonia virus of mice，MPV）、仙台病毒（Sendai virus，SV）、呼肠孤病毒3型（reovirus type 3，Reo-3）、小鼠细小病毒（parvovirus minute virus of mice，MVM）、鼠痘病毒（ectromelia virus，EV）均来自上海实验动物研究中心。上述病毒样品经核酸分离提取制备成DNA或cDNA备用。

1.3 核酸抽提及cDNA模板制备

取100 μL待检上清液或血清，加1 mL TRIzol试剂进行RNA提取；加30 μL DEPC水溶解RNA沉淀。取11 μL RNA溶液，加5倍逆转录酶浓缩缓冲液 4 μL、dNTP 1 μL、随机引物 1 μL、RNA酶抑制剂1 μL、AMV逆转录酶2 μL，置PCR仪上42 ℃反应1 h，即得cDNA模板。对照DNA病毒样本采用DNA抽提试剂盒进行，最后将提取的DNA用50 μL水溶解。

1.4 PCR检测

针对LCMV基因保守区域设计引物，扩增基因片段大小为554 bp，其上游引物为：5'-AGT GAT GAG TCC TTC ACA TCC CA-3'；下游引物为：5'-GGA TCC TAG GCA TTT GAT TGC GC-3'。在PCR薄壁管中，加cDNA或DNA模板1 μL，10倍 Taq 酶浓缩缓冲液 2.5 μL，dNTP 0.5 μL，上下游引物各0.25 μL，Taq酶0.25 μL，加水补足总体积至25 μL。将PCR管置于PCR仪上，按如下程序扩增：首先94 ℃ 3 min；然后94 ℃ 15 s，56 ℃15 s，72 ℃ 30 s，35个循环；最后 72 ℃ 3 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像系统拍摄。

1.5 实时荧光RPA引物和探针设计

使用Vector NTI Suite软件，分析不同国家和地区分离的LCMV基因保守序列，用Primer Express软件设计实时荧光RPA引物和探针。实时荧光RPA检测的上游引物（RPA-LCMVF）序列为：5'-ATG ATG CAG TCC ATG AGA GCA CAG TGT GGG GTG-3'；下游引物（RPA-LCMVR）序列为：5'-GCA CAA CCG GGA TTA ACT TCC TCA GTA ATT GGC-3'。RPA探针（RPA-LCMVP）序列为：CCC TTC TAT TCT GTG AGT CTA AGA GTT TCC TGA（FAM-dt）（THF）（BHQ1-dt）ATC AGA CCC TTG-C3Spacer。引物和探针由上海辉睿生物科技有限公司合成。

1.6 实时荧光RPA检测

采用GENIE Ⅱ恒温扩增PCR仪。反应体系为：25 μL 2 倍反应缓冲液、7.2 μL dNTP、5 μL 10 倍探针酶混合物，上下游引物（RPA-LCMVF、RPALCMVR）各 2.1 μL、10 μmol/L 荧光探针 0.6 μL。混匀后，再加入2.5 μL 20倍核心反应液、1 μL 50倍RT反应液、1 μL 50倍Exo反应液；混匀后，最后加入2.5 μL 280 mmol/L醋酸镁、1 μL待检核酸溶液。反应条件为：39 ℃孵育25 min。反应结束后，查看荧光扩增曲线进行结果判定。

2 结果

2.1 特异性试验

分析LCMV基因序列，设计引物和荧光探针，建立了LCMV荧光RPA方法。使用该方法分别检测鼠LCMV、MHV、MPV、SV、Reo-3、MVM和EV等病毒核酸，同时使用PCR方法进行对比检测。结果显示：经实时荧光RPA检测，LCMV核酸样品在反应5～10 min后荧光信号出现显著增强，而其他鼠病毒核酸样品均未检测到荧光信号的变化（图1）；PCR检测得到了相同结果，仅LCMV核酸样品扩增出了554 bp的单一基因片段，其他鼠病毒未出现基因扩增（图2）。

图1 实时荧光RPA检测LCMV的特异性试验结果

2.2 敏感性试验

为测试建立的实时荧光RPA检测方法的敏感性，将LCMV的cDNA进行定量并梯度稀释，制备浓度分别为 1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL、0.1 fg/μL的模板，再用建立的实时荧光RPA方法和RT-PCR方法进行对比检测。结果显示，实时荧光RPA和RT-PCR方法的检测下限均为1 pg/μL（图3、图4）。

图2 RT-PCR检测LCMV的特异性试验

图3 实时荧光RPA检测LCMV的敏感性试验

图4 RT-PCR检测LCMV的敏感性试验

2.3 感染鼠的组织样本检测

为验证建立的RPA检测方法的可靠性，将实时荧光RPA方法应用于LCMV感染鼠的组织样本和30份LCMV阴性血液样本检测，并使用RT-PCR方法进行验证。结果显示：使用实时荧光RPA方法能在LCMV感染鼠的脑、肝、脾、肺、肾、血液等组织样本检测到显著增强的荧光信号，而LCMV阴性样本均未出现荧光曲线扩增；RT-PCR在这些LCMV阳性组织样本中扩增出了条带单一的554 bp的基因片段，而阴性样本均未出现扩增（图5、图6）。

图5 实时荧光RPA检测LCMV感染鼠的组织样本

图6 RT-PCR检测LCMV感染鼠的组织样本

3 讨论

近年来实验动物的LCMV感染率一直保持较低水平，这与实验动物硬件设施和管理水平的提高密不可分。由于LCMV隐性感染率较高，大多不出现明显的临床症状，因此依赖传统的血清学检测方法可能存在较高的漏检率。同时，由于LCMV的宿主范围较广，并可在环境中长期存活，所以做好防范工作，提高检测和监测效率，是降低实验动物LCMV感染的重要保障。为此，本研究建立了LCMV实时荧光RPA快速检测方法。该实时荧光RPA检测方法具有良好的特异性，与LCMV同步检测的MHV、MPV、SV、Reo-3、MVM和EV等病毒均未出现RPA荧光信号的扩增。通过与传统RT-PCR检测方法比对，证实该实时荧光RPA检测LCMV的方法具有与RT-PCR一致的特异性和敏感性。将建立的实时荧光RPA方法应用于LCMV感染鼠的脑、肝、脾、肺、肾、血液等组织样本和30份LCMV阴性血清样本检测，证实建立的实时荧光RPA方法具有与RT-PCR一致的稳定性和可靠性，实时荧光RPA检测中未出现阳性样品的漏检以及阴性样品的误检出。而与传统RT-PCR方法相比，实时荧光RPA检测方法的优势在于检测周期极短，包括结果判读在内，仅需10～20 min；操作简单，只需将核酸与检测体系混合放于恒温设备中即可，RNA检测不需逆转录过程；检测设备便携，笔记本大小，一次充电可运行12 h；结果判定简便直观，特别适合于现场及野外使用。

本研究建立的实时荧光RPA快速检测方法丰富了现有的LCMV检测体系，特别适合于野外监测点、啮齿类实验动物繁育场和一线兽医检测实验室使用，对控制LCMV传播，保护养殖人员和实验操作人员的健康，减少养殖场的经济损失具有重要意义。