microRNA-25通过HMGB1途径降低缺氧/复氧H9C2心肌细胞纤维化①

刘启方 黄 晶 田龙海 安亚平 岳 峰

(贵州省人民医院心内科，贵阳550002)

心肌缺血再灌注损伤是心脏缺血后伴随血流再通而发生的病理生理过程，研究证明缺血后的心肌重新恢复血流灌注会导致心肌细胞凋亡及心肌纤维化[1]。心肌纤维化(Myocardial fibrosis，MF)是心肌组织病理性的细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)积聚，导致心肌僵硬，舒张或收缩功能下降，最终引起心力衰竭。它在多种心血管疾病中普遍存在，是心室重构的主要表现[2，3]。miRNA-25作为在心脏中相对高表达的miRNA，参与心肌纤维化、心脏重构、心力衰竭等许多病理生理的调控[4，5]。H9C2心肌细胞是来源于胚胎期心脏组织的细胞,与原代心肌细胞相比，H9C2细胞具有增殖分裂的能力，其电生理、细胞信号传导通路及许多生物学活性与原代心肌细胞相似。本研究通过构建高表达miR-25 H9C2稳定细胞系，探讨miR-25对缺氧/复氧诱导的心肌纤维化的作用及机制。

1 材料与方法

1.1材料与仪器 H9C2心肌细胞株来自中国科学院上海细胞库；DMEM培养基、胎牛血清及HMGB1抗体购自Gibco公司，TIMP2、MMP2、CollagenⅠ、CollagenⅢ、Fibronectin、TGF-β、P-smad3及P-ERK1/2抗体购自Abcam公司；RIPA裂解液(强)、Bradford蛋白浓度测定试剂盒、BCA蛋白浓度检测试剂盒购自江苏碧云天生物有限公司。荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；稳压电泳仪(美国HealForce公司)；紫外可见分光光度计(上海spectrum公司)。

1.2方法

1.2.1H9C2细胞培养与转染 在超净台中将保存的细胞悬液转入5 ml配制好的DMEM培养基的离心管中。混匀后离心，去上清液，加入5 ml新的DMEM培养基，吹打均匀后接种于细胞培养瓶中继续培养。选取处于生长期的H9C2细胞作为转染对象，调节细胞浓度至1×105ml-1，取6孔培养板,每孔分别接种2 ml细胞悬液，培养24 h后进行慢病毒感染。实验分为5组：Control组为空白对照组未进行转染；阴性对照组Lv-control组和Lv-anti-control组分别转染Lv-control-miRNA mimic及Lv-control-miRNA inhibitor；实验组Lv-miR-25组和Lv-anti-miR-25组分别转染Lv-miR-25 mimic及Lv-miR-25 inhibitor。向转染组细胞悬液中分别加入polybrene溶液(终浓度5 μg/ml)以及慢病毒载体,用吸管吹打均匀后接种于6孔板，6 h后加入新鲜培养基，观察细胞生长，细胞完全贴壁后，更换新鲜DMEM培养基。当细胞汇合度约80%以上，加入含嘌呤霉素的培养基筛选获得不稳定表达的细胞株。扩大培养各感染组阳性细胞。

1.2.2Real-time PCR检测miR-25表达 采用Real-time PCR检测miR-25高表达稳定细胞系构建成功，miR-25 的逆转录引物为5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGA-CTCAGACC-3′。PCR的上游引物为5′-ATCCAG-TGCGTGTCGTG-3′，下游引物为5′-TGCTCATTGCACTTGTCTC-3′。PCR的扩增条件为 95℃ 预变性 1 min、95℃ 变性 10 s、60℃ 退火、延伸 40 s，重复 40 个循环。计算miR-25的mRNA相对表达量。

1.2.3构建缺氧/复氧损伤H9C2细胞模型 新鲜的DMEM培养液，用CO2和氮气的混合气体充分饱和4 h后，加入小牛血清制成缺氧培养液。将转染后扩大培养的各组细胞，加入胰酶消化，离心，去上清液，接种于缺氧培养液。在37℃缺氧培养箱(1%O2、5%CO2、94%N2)培养的各组H9C2细胞24 h构建缺氧模型；缺氧模型构建后，取出培养瓶，加入胰酶消化，离心。去上清液，加入新鲜培养液放置37℃常氧培养箱(95%空气和5%CO2)培养心肌细胞1 h,构建复氧模型。

1.2.4Real-time PCR检测干预miR-25的表达对HMGB1表达的影响 Real-time PCR检测Control组、Lv-control组、Lv-anti-control组、Lv-control-miRNA mimic组、Lv-control-miRNA inhibitor组的HMGB1表达。按照Trizol法提取各组细胞总RNA，琼脂糖凝胶电泳验证总RNA的完整性。再根据反转录试剂盒说明书将RNA反转录成cDNA。以cDNA为模板，HMBG1上游引物5′-CCGGATGCTTCTGTCAACTT-3′,下游引物5′-TTGATTTTTGGGCGGTACTC-3′，扩增产物的长度是248 bp。实时荧光定量PCR的反应条件为：95%预变性5 min，95%变性10 s、60%退火20 s，延伸20 s进行40个循环。计算各组HMGB1的mRNA相对表达量。

1.2.5Western blot检测Fibronectin、MMP2、TIMP2、CollagenⅠ及CollagenⅢ的蛋白水平 取待测组织于EP管中，加入蛋白裂解液，离心沉淀提取全蛋白。调整蛋白量，Brad-ford 法测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳分离蛋白样品，半干法转移凝胶至PVDF膜，5%BSA慢摇4 h封闭膜，洗膜后加入Ⅰ抗4℃孵育24 h，TBST洗涤，加入Ⅱ抗孵育2 h,TBST洗涤，慢摇2 h后，进行ECL显色。

1.2.6转染HMGB1-shRNA抑制HMGB1的表达，Western blot检测HMGB1、MMP2、TIMP2、CollagenⅠ及CollagenⅢ的蛋白水平 将对数生长期的H9C2细胞接种于6孔板上，待细胞生长达80%融合时进行转染。按照脂质体转染试剂Lipofectamine2000试剂盒说明将control-shRNA与HMGB1-shRNA分别转染H9C2细胞，实验分control-shRNA组、HMGB1-shRNA组。转染6 h后更换培养液继续培养，于37℃，5%CO2培养箱孵育48 h。转染成功后行缺氧/复氧损伤处理后，检测HMGB1、MMP2、TIMP2、CollagenⅠ及CollagenⅢ的蛋白表达。

1.2.7双荧光素报告基因检测miR-25与HMGB1的靶向作用 从NCBI中下载人HMGB1-3′UTR基因序列，NCBI Reference Sequence为NM_002128.4，采用Primer5.0软件进行引物设计。通过琼脂糖凝胶电泳将扩增条带分离，然后将纯化的扩增片段收回，克隆进入psiCHECKTM-2 载体，构建HMGB1-3′UTR-psiCHECKTM-2与Mut-HMGB1-3′UTR-psiCHE-CKTM-2载体。将miRNA-25与质粒共转染细胞，转染前一天取24孔培养板，每孔接种2×104个细胞，用含10%小牛血清的高糖DMEM培养基继续培养，将脂质转染试剂与质粒及miRNA-25溶液混合，在37℃恒温培养箱中孵育5 h后，换新鲜的含血清DMEM培养基。细胞转染后2 d，制成细胞裂解液。加入预先配好的用于Lucifersae检测的工作液，采用生物发光检测仪读取背景值。

2 结果

2.1RT-PCR法检测miR-25 mimic/inhibitor在H9C2细胞中的表达效率 在H9C2细胞中转染Lv-control、Lv-miR-25、Lv-anti-control、Lv-anti-miR-25构建稳定细胞系，使用real-time PCR检测各转染组H9C2心肌细胞miR-25的表达。结果显示相比于Lv-control对照组，Lv-miR-25组 H9C2心肌细胞中miR-25的表达水平显著升高，差异具有统计学意义(P<0.01)，而Lv-anti-miR-25组H9C2心肌细胞中miR-25的表达水平明显下降，与空白对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.01),见图1。

图1 miR-25的表达Fig.1 Expression level of miR-25Note: *.P<0.01.

2.2Real-time PCR检测干预miR-25表达的缺氧/复氧损伤H9C2细胞的HMGB1表达 在H9C2细胞中转染Lv-control、Lv-miR-25、Lv-anti-control、Lv-anti-miR-25构建稳定细胞系，行缺氧24 h/复氧 1 h处理后，收集细胞，提取各组细胞总RNA，Real-time PCR检测各转染组缺氧/复氧H9C2心肌细胞HMGB1的表达。结果显示相比于Lv-control对照组，Lv-miR-25组 缺氧/复氧H9C2心肌细胞中HMGB1的表达水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01)，而Lv-anti-miR-25组H9C2心肌细胞中HMGB1的表达水平明显升高，与空白对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.01),见图2。

2.3Western blot检测H9C2细胞HMGB1及纤维化因子的表达水平 构建高表达miR-25 H9C2稳定细胞系，行缺氧24 h/复氧 1 h处理后，收集细胞，提取总蛋白，采用Western blot的方法检测HMGB1、Fibronectin、CollagenⅢ、CollagenⅠ、MMP2、TIMP2蛋白的表达水平。结果显示与Lv-control组相比，Lv-miR-25组HMGB1的蛋白表达下降，与RT-PCR检测结果一致，高表达miR-25降低HMGB1的表达。同样与Lv-control组相比，Lv-miR-25组的Fibronectin、CollagenⅢ、CollagenⅠ、MMP2、TIMP2蛋白表达显著下降，而Lv-anti-miR-25组的蛋白表达水平显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05),见图3。

2.4Western blot检测HMGB1-shRNA在H9C2细胞中表达效率 构建了干扰HMGB1慢病毒载体(Lv-HMGB1-shRNA)、阴性对照慢病毒载体(Lv-Control-shRNA),并将其转染H9C2心肌细胞，培养后筛选出稳定细胞系。通过Real-time PCR检测各转染组H9C2心肌细胞HMGB1的表达,结果显示相比于阴性对照组，HMGB1-shRHA组HMGB1 mRNA表达量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01),见图4 。

图2 HMGB1的表达Fig.2 Expression level of HMGB1Note: *.P<0.01.

图3 Western blot检测蛋白的表达Fig.3 Expression of protein determined by Western blotNote: *.P<0.05.

图4 Western blot检测HMGB1蛋白表达Fig.4 Expression of HMGB1 protein determined by Western blotNote: *.P<0.01.

图5 Western blot检测纤维相关蛋白的表达Fig.5 Expression of fibrosis-related protein determined by Western blotNote: *.P<0.05.

2.5Western blot检测沉默HMGB1的H9C2细胞纤维化因子的表达水平 对干扰HMGB1表达的稳定细胞系行缺氧/复氧损伤处理后，收集细胞，提取总蛋白，采用Western blot的方法检测TIMP2、MMP2、CollagenⅢ、CollagenⅠ蛋白的表达水平。结果显示与对照组相比，Lv-HMGB1-shRNA组纤维蛋白表达显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图5。

2.6miR-25靶向调控HMGB1表达 用micro-RNA.org-Targets and Expression进行HMGB1的miRNA

图6 miR-25与HMGB1的 非翻译区序列互补(3′-UTR)Fig.6 Sequence complementarity of miR-25 and untransl-ated region of HMGB1 gene(3′-UTR)

图7 双荧光素报告基因检测Fig.7 Dual-luciferase reporter gene assayNote: *.P<0.05.

预测，发现miR-25与HMGB1的非翻译区序列互补，见图6。通过分别转染 miR-25 mimic、miR-25 inhibitor、NC-miRNA 或 NC-miRNA inhibitor和HMGB1-3′UTR-psiCHECKTM-2(野生型)与Mut-HMGB1-3′UTR-psiCHECKTM-2(突变型)荧光素酶报告基因载体进入H9C2细胞，测定荧光素酶活性的变化。发现转染miR-25mimic后，相对于空白对照组，携带有HMGB1野生型报告基因载体组的荧光素酶信号强度下降了约50%，而携带有HMGB1突变型报告基因载体组在转染miR-25mimic后荧光素酶信号强度没有明显变化，表明miR-25靶向调控 HMGB1基因，见图7。

3 讨论

ECM主要由胶原蛋白Ⅰ型和胶原蛋白Ⅲ型组成，占ECM的80%～90%左右，其他为黏连蛋白、弹性蛋白及其他胶原蛋白等[6]。基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)特异性降解ECM成分的Zn2+依赖的酶家族，TIMPs是MMPs的特异性抑制因子，其抑制MMPs对ECM的降解[7]。心肌细胞纤维化同样与胶原蛋白Ⅰ型、胶原蛋白Ⅲ型、TIMPs及MMPs表达水平相关。MMPs家族中MMP2在心肌组织中表达水平较高，是心肌内抗纤维化的重要成分[8]。在TIMPs家族中，TIMP2对MMPs的抑制作用最强。MMP2的天然抑制物TIMP2也存在于心肌组织中，并可通过与相应的MMP2结合从而影响其活性，MMP2/TIMP2的平衡对维持心肌正常的胶原代谢具有重要意义[9，10]。因此本研究通过检测胶原蛋白Ⅰ型、胶原蛋白Ⅲ型、MMP2及TIMP2能反映心肌细胞纤维化的程度。

本实验通过慢病毒构建高表达miR-25的稳定细胞系后，行缺氧/复氧处理，结果提示高表达miR-25的胶原蛋白Ⅰ型、胶原蛋白Ⅲ型、MMP2及TIMP2蛋白表达减少，心肌细胞纤维化减少。转染miR-25 inhibitor的稳定细胞系，得到相反的结果。miR-25对缺氧/复氧H9C2心肌细胞具有降低纤维化的作用。Tang等[11]研究发现在TGF-β1诱导上皮细胞间质化过程中，miR-25表达下调，高表达miR-25能减少上皮细胞间质化，降低纤维化进程。本研究得到miR-25降低纤维化作用与Tang的研究结果一致。

HMGB1导致心肌纤维化途径非常复杂，Su等[12]研究发现HMGB1与TLR结合，经与丝/苏氨酸蛋白激酶相互作用，激活ERK途径导致心肌胶原沉积。Wang等[13]在糖尿病心肌病的大鼠模型研究中发现，抑制HMGB1的表达能够降低胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ的沉积，改善左心室功能障碍。本研究通过转染shRNA-HMGB1沉默H9C2细胞HMGB1的表达，行缺氧/复氧处理，结果显示下调HMGB1表达，导致胶原蛋白Ⅰ型、胶原蛋白Ⅲ型、MMP2及TIMP2的蛋白表达降低，纤维化减轻。由此可见，与既往文献报道结果一样，HMGB1有促进纤维化作用。

研究结果发现miR-25与HMGB1均参与纤维化的进程；MicroRNA.org-Targets and Expression进行HMGB1的miRNA预测，发现miR-25与HMGB1存在潜在的靶向作用，见图6。实验通过干预miR-25的表达，检测其变化对HMGB1表达的影响，结果发现二者呈负向调控关系，高表达miR-25，HMGB1表达下调；低表达miR-25，HMGB1表达上调。同时实验通过双荧光素报告基因证实miR-25对HMGB1有靶向调控作用，据此推断miR-25通过下调HMGB1表达发挥其降低心肌细胞纤维化的作用。本研究虽然证实miR-25经HMGB1途径调控心肌细胞纤维化进程，但未能进一步探讨HMGB1导致心肌细胞纤维化的机制，以及miR-25是否也会经由其他途径调控心肌细胞纤维化的进程，对此应继续深入研究。