红景天苷调节Nrf2/ROS通路增强U-251MG的放射敏感性①

张蕴蕴 周 宪 吴永忠

(重庆大学附属肿瘤医院放疗科，重庆400030)

星形胶质瘤是原发性脑瘤中发病率最高的一类肿瘤[1]。手术是治疗脑瘤的首选方法，显微神经外科手术在保护正常神经组织的情况下，能尽量切除肿瘤组织[2]。由于手术往往无法彻底切除发生侵袭的肿瘤细胞，患者术后需进行放疗，但是许多肿瘤具有放疗对抗性，使放疗效果不佳[3,4]。尽管临床治疗采取多种方式，但恶性胶质瘤仍容易复发。据统计恶性胶质瘤确诊后，通常术后存活期为12～15个月，5年存活率不足5%[5]。世卫组织统计，恶性胶质瘤是引起34岁以下肿瘤患者死亡的第二大原因[6]。中药联合放疗有增加肿瘤放射敏感性和减轻毒副反应的作用，在临床上应用较广。红景天是广泛生长于亚洲和欧洲高寒地带的珍贵药材，被称为高原人参。红景天苷(Salidroside，SD)是从红景天中提取出的主要活性成分[7]。研究显示，红景天苷具有广泛的药理活性，如增强免疫力、抗氧化和提高人体机能等[8,9]。研究显示红景天苷有治疗抑郁、保护神经和潜在治疗癌症的作用[10,11]。随着技术和治疗策略的进步，胶质瘤的治疗和预后取得一定进展，但5年存活率仍然很低。因此研究胶质瘤发生发展机理和开发新的治疗策略十分重要。本文研究红景天苷对人星形胶质瘤U-251MG放射敏感性的影响及潜在的分子机制。

1 材料与方法

1.1材料 红景天苷购自北京索莱宝科技有限公司；U-251MG细胞株购自中国科学院细胞库；DMEM高糖培养基和胎牛血清购自Gibco；CCK8试剂盒购自默沙克生物；总SOD检测试剂盒、Gpx检测试剂盒、MDA检测试剂盒购自碧云天生物技术公司；ROS检测试剂盒购自上海翊圣生物公司；Bcl-2(ab32124)、BAX(ab32530)、Nrf2(ab71890)、HO-1(ab68477)、NQO-1(ab34173)、Ki67(ab833)、PCNA(ab15497)、β-Actin(ab8227)抗体购自Abcam公司；山羊抗兔二抗购自艾美捷科技公司。

1.2方法

1.2.1细胞的培养及分组 U-251MG细胞接种于90%DMEM+10%胎牛血清的培养基中，5%CO2、37℃培养箱中培养。将人星形胶质瘤细胞U-251MG随机分成4组：对照组、红景天苷单独处理组(SD)、放疗组和放射+SD组。SD组和放射+SD组细胞贴壁后，换含50 nmol/L红景天苷的培养基培养；放疗组和放射+SD组细胞用6 MV X射线医用直线加速器照射，剂量率为2 Gy/min，射野大小为10 cm×10 cm，给予剂量为10 Gy。在放疗结束后48 h，收集细胞进行实验分析。

1.2.2CCK8检测 向96孔板中加100 μl细胞悬液，将细胞在正常条件下预培养。待细胞贴壁后，SD组和放射+SD组细胞用含50 nmol/L红景天苷的培养基培养，对照组和放疗组使用正常的培养基培养，放疗组和更换培养基后的放射+SD组细胞使用射线处理。处理后各组细胞正常培养24、48、72、96 h，每孔加10 μl CCK8溶液，混匀后，培养箱中培养2 h，酶标仪测定450 nm处吸光值。

1.2.3流式细胞术 红景天苷和放射处理后各组细胞继续培养48 h，胰酶将细胞消化成单个悬浮细胞，4℃离心机中1 000 r/min离心5 min，收集细胞，弃上清，预冷的PBS洗2次。细胞用100 μl结合缓冲液，加Annexin-V-FITC，混匀后避光冰上静置15 min。转移至流式检测管，加PBS，上机前2 min加PI，迅速检测。

1.2.4氧化应激指标的检测 收集细胞，用预冷的PBS洗2次后重悬，超声破碎，离心取上清作为待检测样品。按照相关试剂盒说明书，检测氧化应激指标。

1.2.5蛋白质印迹 收集细胞，加含苯甲基磺酰氟的细胞裂解液，冰上裂解30 min。4℃离心机中12 000 r/min 离心，上清为总蛋白。BCA法检测上清中总蛋白含量，加5×蛋白上样缓冲液，混匀后，沸水浴10 min，15 000 r/min离心10 min；等量蛋白样品用12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。转移至PVDF膜，加入含5%脱脂牛奶的TBST缓冲液中，室温下封闭1 h；转移膜至一抗液，4℃孵育过夜，TBST洗3次，每次10 min；转移至二抗液，室温下孵育2 h，TBST洗3次，每次10 min；加显影液，显影及拍照。

1.2.6裸鼠分组及处理 裸鼠经腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉后，立体定向仪固定头部。切开头部皮肤后，用电钻于冠状缝与矢状缝交点后钻1 mm3小孔。取对数生长期细胞，经胰酶消化成单个细胞悬液，用不含血清的培养基洗2次。每只注射100 μl，接种5×105个细胞。接种1周后，将20只雄性裸鼠随机分成4组：对照组、红景天苷单独处理组(SD)、放疗组和放射+SD组，每组5只。SD组和放射+SD组大鼠腹腔注射红景天苷50 nmol/kg，隔天1次。放疗组和放射+SD组裸鼠用6 MV X射线照射，剂量率为2 Gy/min，距离100 cm、厚3 mm的铅板遮住裸鼠其他部位，给予剂量为10 Gy，放射+SD组放疗在细胞腹腔给药后1 d进行，1周1次，共治疗4周。

1.2.7免疫组化 腹腔注射戊巴比妥钠麻醉裸鼠，剪开胸腔暴露心脏，注射器经左心室进主动脉，剪开右心耳，生理药水清洗，直到肝组织变白，加4%多聚甲醛灌注30 min，共300 ml。取肿瘤组织，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，切片厚度为5 μm。取石蜡切片，60℃烘片30 min，脱蜡至水，PBS洗3次。加入柠檬酸盐缓冲液，微波炉中处理10 min，自然冷却，PBS清洗3次，加3%过氧化氢，室温孵育10 min，5%正常山羊血清封闭，室温孵育10 min，加一抗，4℃过夜，PBS冲洗3次；加工作液，37℃温育15 min，PBS冲洗3次，显色剂显色，自来水充分冲洗，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.3统计学方法 采用统计软件SPSS18.0分析实验数据；两组间比较采用t检验；P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1红景天苷增强放疗对U-251MG细胞增殖的抑制作用 CCK8实验结果显示，与对照组相比，SD组和放疗组U-251MG细胞增殖能力明显下降(图1，P<0.05)；放射+SD组与SD组、放射组相比，细胞增殖倍数明显降低。结果表明，红景天苷和放疗单独使用时，均能抑制U-251MG细胞增殖，红景天苷促进放疗对U-251MG细胞增殖的抑制作用。

2.2红景天苷增强放疗对U-251MG细胞凋亡的促进作用 实验结果显示，与对照组相比，SD组和放疗组Q2区细胞数目明显增加，细胞凋亡比率显著增加(图2，P<0.05)，提示红景天苷和放疗单独使用具有促进U-251MG细胞凋亡的作用。放射+SD组与SD组、放疗组相比，细胞凋亡比率显著增加(图2，P<0.05)。实验结果表明，红景天苷增强放疗诱导的U-251MG细胞凋亡。

2.3红景天苷增强放疗对凋亡相关蛋白表达的影响 与对照组比，SD组和放疗组细胞中Bax的表达显著上调，Bcl-2的表达显著下调(图3，P<0.05)。与SD组和放疗组相比，放射+SD组细胞中Bax的表达显著上调，Bcl-2的表达显著下调(图3，P<0.05)。实验结果表明，红景天苷增强放疗提升U-251MG细胞中Bax/Bcl-2比率的作用。

2.4红景天苷增强放疗对U-251MG氧化应激反应的诱导作用 与对照组相比，SD组和放疗组细胞中ROS和MDA的含量显著升高，SOD和Gpx的活性显著降低(图4，P<0.05)，结果提示红景天苷和放疗在单独使用时，都能诱导U-251MG细胞氧化应激反应。与SD组和放疗组相比，放射+SD组细胞中ROS和MDA的含量显著上升，SOD和Gpx的活性显著降低(图4，P<0.05)。实验结果表明，红景天苷促进放疗诱导的U-251MG细胞氧化应激反应。

图1 CCK8检测细胞增殖Fig.1 CCK8 to detect cell proliferation folds of each group cellsNote: Compared with the control group，**.P<0.01;compared with the SD group or the Radiation group，##.P<0.01.

图2 流式细胞术检测细胞凋亡Fig.2 Flow cytometry to detect apoptosis of each group cellsNote: Compared with the control group，*.P<0.05;compared with the SD group or the Radiation group,#.P<0.05.

图3 蛋白质印迹检测凋亡相关蛋白表达Fig.3 Western blot to detect expression of apoptosis related proteinsNote: Compared with the control group，*.P<0.05;compared with the SD group or the Radiation group，#.P<0.05.

图4 氧化应激指标的检测Fig.4 Detection of Oxidative stress indicatorNote: Compared with the control group，*.P<0.05;compared with the SD group or the Radiation group，#.P<0.05.

2.5红景天苷增强放疗对Nrf2通路相关蛋白表达的影响 与对照组相比，SD组和放疗组Nrf2的表达无明显变化(图5，P>0.05)；SD组HO-1的表达显著下调(图5，P<0.05)，NQO-1的表达没有显著差异(图5，P>0.05)，放疗组NQO-1的表达显著下调(图5，P<0.05)。放射+SD组与SD组、放疗组相比，Nrf2、HO-1和NQO-1的表达均显著下调(图5，P<0.05)。实验结果表明，红景天苷增强放疗对Nrf2通路相关蛋白表达的影响。

2.6红景天增强放疗对小鼠体内U-251MG胶质瘤生长的抑制作用 与对照组相比，SD组和放疗组裸鼠体内肿瘤重量显著下降，肿瘤组织中Ki67和PCNA的表达显著下调(图6，P<0.05)。放射+SD组与SD组、放疗组相比，裸鼠体内肿瘤重量显著降低，肿瘤组织中Ki67和PCNA的表达显著下调；(图6，P<0.05)。实验结果表明，红景天苷增强放疗对小鼠体内胶质瘤U-251MG生长的抑制作用。

图5 蛋白质印迹检测Nrf2通路相关蛋白的表达Fig.5 Western blot to detect expression of Nrf2 pathway related proteinsNote: Compared with the control group，*.P<0.05;compared with the SD group or the Radiation group,#.P<0.05.

图6 红景天苷对U-251MG生长的影响

Fig.6 Effect of Salidroside on growth of U-251MG

Note: A.Tumor weight was detected in Vivo;B.Expression of Ki67 was detected by immunohistochemical;C.Expression of PCNA was detected by immunohistochemical.Compared with the control group，*.P<0.05;compared with the SD group or the Radiation group，#.P<0.05.

3 讨论

肿瘤放射治疗是利用放射线治疗肿瘤的一种局部治疗方法。大约70%的癌症患者需要接受放射治疗，放射疗法是治疗恶性肿瘤的主要方法之一[12]。放射治疗的效果取决于癌细胞的放射敏感性，增殖活跃的细胞敏感性更高[13]。正常生理条件下，增殖和凋亡共同维持机体的平衡，在肿瘤的发生发展过程中，细胞凋亡受到抑制，而增殖不受限。许多研究发现，红景天苷具有抑制肿瘤细胞增殖的作用，如Hu等[14]研究发现，红景天苷能抑制乳腺癌、肝癌、胃癌和恶性胶质瘤的细胞增殖，增殖的抑制与G1/G2期阻滞有关。本文研究结果与前人研究一致，红景天苷单独使用时能抑制U-251MG细胞增殖，增强放疗对U-251MG增殖的抑制作用。

在肿瘤的治疗中，放疗通过诱导细胞凋亡达到治疗的目的。放疗细胞经红景天苷加药处理后，凋亡细胞比率显著上升。Zeng等[11]研究发现，红景天苷能诱导卵巢癌凋亡；Fan等[15]研究发现红景天苷诱导结直肠癌细胞凋亡。Western blot实验进一步验证红景天苷对细胞凋亡相关蛋白表达的影响。Bcl-2家族在凋亡的调控过程中发挥重要作用，其中Bax抑制凋亡，Bcl-2促进凋亡[16]。在多数肿瘤中，Bax表达下调，Bcl-2表达上调[17]。许多抗肿瘤药物将凋亡相关蛋白作为治疗癌症的靶向蛋白[18]。本研究结果显示，射线照射后的细胞加红景天苷处理后，细胞中Bax/Bcl-2显著升高，表明红景天苷增强放疗对U-251MG细胞凋亡的诱导作用。

细胞结构受到损伤时，ROS的含量急剧升高，MDA是脂质氧化损伤的重要标志[19]。Gpx内源性抗氧化剂，催化过氧化氢分解，保护生物膜的完整性[20]。目前认为射线直接作用于有机分子产生自由基，引起DNA损伤和与生物大分子反应，导致不可逆损伤[21]。研究结果显示，红景天苷在单独使用时，能促进U-251MG细胞氧化应激。加药处理放射细胞后，增强放疗对U-251MG氧化应激反应的诱导作用。

Nrf2通路能启动下游多种保护性蛋白的表达，如抗氧化类、解毒酶类、分子伴侣等[22]。HO-1和NQO-1是Nrf2下游关键蛋白，HO-1能抗氧化、抑制细胞凋亡；NQO-1为还原型辅酶/醌氧化还原酶，催化毒性的苯醌转化为低毒性的氢醌和羟基化合物，在机体的解毒代谢中发挥重要作用[23]。研究显示，在U-251MG中Nrf2高表达，进而刺激下游解毒和抗氧化基因的表达，增强肿瘤的抗放射性和耐药性[24]。本研究结果显示，红景天苷下调放疗组U-251MG细胞中Nrf2、HO-1和NQO-1的表达，减弱U-251MG细胞的解毒和抗氧化能力。

体内实验中，腹腔注射红景天苷到模型裸鼠后进行放疗，肿瘤生长速度明显放缓，且放射+SD组裸鼠肿瘤组织中Ki67和PCNA的阳性细胞明显较少。Ki67和PCNA是肿瘤细胞增殖能力良好的指标[25]，阳性细胞减少表明增殖速度减缓。表明体内实验中，红景天苷增强放疗对U-251MG增殖的抑制作用。

综上所述，本文通过体内和体外实验，发现红景天苷可能通过调节Nrf2/ROS通路，增强放疗对U-251MG增殖的抑制作用、凋亡和氧化应激的诱导作用。