136例OSCC队列中肿瘤细胞的HIPK2表达情况及临床病理观察①

谢莉莉 廖天安 谢 奇 邓 旎

(海南省人民医院口腔科，海口570102)

口腔鳞状细胞癌(Oral squamous cell carcinoma，OSCC)发病率在口腔癌症中占90%，由于预后不良，OSCC是世界范围内致死率较高的癌症之一[1]。营养缺乏、食用富含亚硝胺或霉菌毒素的食物和低社会经济地位可能会导致OSCC发生[2]。尽管治疗方案不断完善，但OSCC的5年生存率仍低于60%。除了分化和肿瘤淋巴结转移(Tumor lymph node metastasis，TNM)分期之外，几乎没有任何预测因子可以预测OSCC患者的预后。在这种情况下，确定潜在的分子标记和靶点是预测OSCC患者5年总生存期(Overall survival，OS)和无复发生存期(Relapse-free survival，RFS)的重要前提[3]。

同源结构域相互作用蛋白激酶-2(Homeodo-main-interacting protein kinase-2，HIPK2)是一种能够影响细胞增殖、凋亡、分化的肿瘤抑制因子[4]。既往研究已经证明HIPK2介导促进成纤维细胞形成、肾小管上皮细胞凋亡和上皮-间充质转化，这意味着它可能是抗纤维化治疗的潜在靶标[5]。HIPK2也被证明在严重DNA损伤后通过与第46位丝氨酸的直接结合和磷酸化来激活p53蛋白[6]。Donninger等[7]证实HIPK2是化疗药物顺铂治疗中调节p53活性的重要因子。Reuven等[8]指出HIPK2敲除可诱导多种抗癌药物(包括多柔比星和顺铂)的耐药性。HIPK2介导的波形蛋白表达下调可能有助于抑制乳腺癌细胞侵袭[9]。然而，目前关于HIPK2在OSCC中的生物学作用和临床意义仍然大部分未知。在本研究中，我们研究了136例OSCC队列中肿瘤细胞的HIPK2表达情况，并确定了其表达与OSCC的临床病理因素、复发和预后的相关性。

1 材料与方法

1.1研究人群 本研究纳入2003～2011年期间在海南省人民医院口腔颌面外科接受治疗的93例男性和43例女性OSCC患者。TNM分类参照2002年国际癌症控制联盟标准(UICC2002)。根据2005年修订的世界卫生组织肿瘤分类要求，病理学检查由2名病理学家独立进行。

1.2免疫组化检测 将石蜡包埋组织以4 μm厚度切片，脱蜡，水化并用过氧化氢去除内源性过氧化物酶。HIPK2染色程序基于试剂盒说明书。经热抗原修复后，将切片与1∶200稀释的小鼠单克隆抗人HIPK2抗体在4℃孵育过夜，然后与EnVision HRP-IgG二抗温育30 min。使用3,3′-二氨基联苯胺(DAB)染色，苏木素复染。由2名口腔病理学家(对患者的临床病理学数据不知情)使用TMA软件模块1.15.2(匈牙利3DHISTECH公司)的半定量评分系统独立分析并打分。量化强度为阴性、弱、中等、强烈，分别计0、1、2、3分。免疫阳性细胞的比例定量如下：阴性为0；<10%为1；10%～50%为2；51%～80%为3；>80%为4。通过将细胞的染色强度和比例分数相乘得到0～12的分数来确定最终的免疫反应性评分。记录每个病例的综合免疫反应评分的平均值。基于免疫反应性评分值，HIPK2评分为低(0～4分)、中(5～8分)、高(9～12分)[10]。整个切片在组织微阵列染色不典型代表的条件下重复操作。在每次实验期间设无一抗的阴性对照。

1.3数据分析 计算OSCC患者的5年总生存期(OS)和无复发生存期(RFS)。OS被定义为从随机化开始至因任何原因引起死亡的时间。RFS被定义为从入院到淋巴结局部或远处转移的时间。所有统计分析均使用SPSS22.0统计软件，HIPK2表达与临床病理特征的关系采用线性相关性检验(年龄、分化程度、T分期、N分期和临床分期)和Pearsonχ2检验(性别、是否吸烟、是否饮酒和肿瘤位置)，使用Kaplan-Meier方法评估患者存活并使用Log-Rank检验进行比较，使用存活数据进行单变量和多变量Cox回归分析，使用Wilcoxon秩和检验进行多重比较以分析不同HIPK2表达程度的平均OSCC存活时间，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1HIPK2表达与临床病理因素的关系 在136例OSCC患者中，HIPK2低表达49例(36.3%)，中表达53例(38.8%)，高表达34例(24.9%)，见图1。患者的中位年龄为60岁(24～85岁)，随访时间平均为3.58年。分析表明，OSCC中HIPK2的表达水平与淋巴结转移显著相关(P<0.001)，但与性别、年龄分布、是否吸烟、是否饮酒、分化程度、肿瘤部位、T分期、临床分期无显著关系(P>0.05)，见表1。值得注意的是，HIPK2与淋巴结转移之间的相关性提示HIPK2在增加OSCC的侵袭和转移中具有潜在作用。

2.2OSCC患者HIPK2表达与预后的关系 为了确定HIPK2表达是否可能是OSCC的预后预测因子，我们通过Kaplan-Meier分析和LogRank检验检查了136例OSCC患者中的HIPK2表达水平和临床随访信息。在随访期间有63例患者死亡，而73例患者在随访结束时仍然存活。单因素分析见表2，临床病理参数如N分期、临床分期和HIPK2表达与5年OS相关(P<0.05)，而T分期、临床分期和HIPK2表达与5年RFS有关(P<0.05)。多因素分析显示T分期、N分期、临床分期和HIPK2表达是OS的独立危险因素(P<0.05)，HIPK2表达是复发的最重要危险因素(表2、3，图2)。结果显示，HIPK2高水平表达的患者中位总生存时间明显低于HIPK2低水平表达患者(P<0.001)和HIPK2中水平表达患者(P<0.001)。此外，HIPK2低表达组(P<0.001)和HIPK2中表达组(P<0.001)的中位无进展生存时间与HIPK2高表达组相比均显著升高。这些结果表明，HIPK2高水平表达患者的预后比低水平HIPK2表达的患者更差(表4)。

图1 HIPK2蛋白在OSCC组织中的免疫组化染色(DAB显色，×400)Fig.1 Immunohistochemistry of HIPK2 protein in OSCC tissues(DAB staining,×400)Note: A.Negative expression in normal oral mucosa;B.Low expression in cytoplasm；C.Medium expression in cytoplasm；D.High expression in cytoplasm.

表1 HIPK2表达与OSCC临床病理特征的关系

Tab.1 Correlation between expression of HIPK2 and clinicopathological features of OSCC

Clinicalpathological featuresSubgroupsnHIPK2 staining valueLow expression(n=49)Medium expression(n=53)High expression(n=34)P valueSexMale9432(34.0%)37(39.4%)25(26.6%)0.272Female4218(42.4%)16(37.6%)8(20.0%)Age(year)<606625(37.9%)25(37.9%)16(24.2%)0.612≥607024(34.3%)28(40.0%)18(25.7%)SmokingYes6623(34.8%)25(37.9%)18(27.3%)0.835No7026(36.9%)28(39.7%)16(23.4%)DrinkingYes6522(33.8%)25(38.5%)18(27.7%)0.464No7127(38.0%)28(39.4%)16(22.6%)Tumor DifferentiationHigh10036(36.0%)41(41.0%)23(23.0%)0.298Medium3211(34.4%)11(34.4%)10(31.2%)low41(25.0%)1(25.0%)2(50.0%)Tumor siteGingiva268(30.8%)10(38.4%)8(30.8%)0.227Tongue6525(38.5%)23(35.4%)17(26.1%)Buccal3013(42.6%)12(39.4%)5(18.0%)Other1)153(20.0%)8(53.3%)4(26.7%)T stageT1-T29334(36.5%)37(39.8%)22(23.7%)0.625T3-T44315(34.9%)16(37.2)12(27.9%)N stageN09136(39.5%)41(45.1%)14(15.4%)<0.001N1-N34513(28.9%)12(26.7%)20(44.4%)Clinical stageⅠ-Ⅱ7127(38.0%)30(42.3%)14(19.7%)0.084Ⅲ-Ⅳ6522(33.8%)23(35.4%)20(30.8%)

Note：1)Others included hard palate,oropharynx and lips.

表2 OSCC患者OS和RFS的选择特征的单因素分析

Tab.2 Univariate analysis of selective characteristics of OS and RFs in OSSC patients

CharacteristicsSubgroups5-years OS(95%CI)P value5-years RFS(95%CI)P valueT stageT1-T20.409(0.261-0.569)0.2210.649(0.538-0.764)0.035T3-T40.248(-0.098-0.596)0.713(0.450-0.981)N stageN00.469(0.289-0.649)<0.0010.667(0.548-0.794)0.584N1-N30.252(-0.101-0.605)0.733(0.620-0.841)Clinical stageⅠ-Ⅱ0.442(0.251-0.622)0.0110.627(0.498-0.749)0.041Ⅲ-Ⅳ0.298(0.049-0.560)0.727(0.527-0.927)HIPK2 staining valueLow expression0.474(0.271-0.676)<0.0010.701(0.558-0.839)0.002Medium expression0.608(0.502-0.725)0.795(0.708-0.881)High expression0.162(0.072-0.248)0.330(0.133-0.793)

表3 多因素COX回归分析OSCC存活因素

Tab.3 Multivariate COX regression analysis on factors for OSCC survival

Characteristics5-years OSHazard ratio(95%CI)P value5-years RFSHazard ratio(95%CI)P valueT stageT1-T2 vs.T3-T40.547(0.331-0.904)0.0191.188(0.483-2.923)0.707N stageN0 vs.N1-N30.238(0.143-0.398)<0.0010.614(0.280-1.347)0.223Clinical stageⅠ-Ⅱ vs.Ⅲ-Ⅳ2.503(1.348-4.649)0.0042.249(0.865-5.852)0.097HIPK2 staining valueLow vs.High0.197(0.123-0.315)<0.0010.451(0.239-0.849)0.014Medium vs.High0.271(0.174-0.422)<0.0010.371(0.192-0.714)0.003

表4 多重比较HIPK2表达强度的中位OSCC存活时间

Tab.4 Multiple comparison with median OSCC survival time of HIPK2 staining value

HIPK2 staining value5-years OSMedian time(range)(months)P value5-years RFSMedian time(range)(months)P valueLow expression43(4-93)<0.00139(2-93)<0.001Medium expression38(2-81)<0.0011)36(2-59)<0.001High expression14(2-56)11(1-54)

图2 不同HIPK2表达强度OSCC患者OS和RFS的Kaplan-Meier曲线Fig.2 Kaplan-Meier curves of 5-years overall survival(OS)and recurrence-free survival(RFS)in OSCC patients with different HIPK2 expression intensity

3 讨论

本研究通过免疫组织化学方法研究了136例OSCC组织中HIPK2的表达情况，结果发现HIPK2在OSCC组织中表达较其相邻的非癌组织相对显著上调，这个结果与以往研究的膀胱癌、乳腺癌和卵巢癌中HIPK2表达情况一致[11,12]。HIPK2是一种核丝氨酸/苏氨酸激酶，作为转录因子的共抑制因子，是HIPK家族的四种多功能激酶之一，它们是各种细胞外刺激的传感器。这些激酶控制关键的细胞功能，如调节细胞凋亡的下游效应子的信号转导、胚胎发育、DNA损伤反应和细胞增殖[13]。因此，HIPK2参与致癌作用。HIPK2过表达在家族性腺瘤性息肉病的宫颈癌和结直肠癌患者中得到证实[14]。目前的研究表明，HIPK2表达与OSCC组织中的淋巴结转移和临床病理特征显著相关。这些结果表明HIPK2是一种潜在的预后新指标，可能是与转移相关的候选肿瘤抑制因子，可以作为OSCC患者的潜在治疗靶点。

多项研究证实了淋巴结转移在侵袭性恶性肿瘤中的作用，早期发生区域淋巴结转移是癌症进展的关键步骤。本研究提供的数据表明OSCC细胞表达的HIPK2可能在OSCC转移中发挥作用，与其他组相比，具有HIPK2高表达的OSCC患者的生存时间显著缩短并且淋巴结受累增多。目前已有大量证据表明HIPK2在扁桃体鳞状细胞癌(Tonsillar squamous cell carcinoma,TSCC)、口咽部鳞状细胞癌(Oropharynx squamous cell carcinoma,OHSCC)、乳腺癌、胃癌、非小细胞肺癌和食管鳞状细胞癌中与肿瘤转移相关，而HIPK2在OSCC组织中转移的分子机制尚不清楚[15]。最新研究发现，HIPK2的上调抑制上皮间充质转化，从而促进了食管鳞状细胞癌细胞的迁移和侵袭，其作用机制与降低间充质标志物N-钙黏蛋白mRNA的水平和增加上皮标志物E-钙黏蛋白的表达，导致细胞与基质相互作用，细胞运动性和侵袭性改变有关[9]。Tan等[16]也证明HIPK2敲除可增加N-钙黏蛋白和纤连蛋白的水平，并降低E-钙黏蛋白的水平，表明上皮间充质转化的发生是HIPK2下调诱导的。因此，淋巴结转移可能是HIPK2高表达的OSCC患者预后不良的重要原因。为了阐明HIPK2表达导致肿瘤细胞淋巴结扩散的机制，有必要通过进一步的分子生物学研究来阐明HIPK2在OSCC中的作用机制。

近年来，大量学者一直致力于提供对OSCC预后信息准确的分子生物学标志物。虽然已有研究报道HIPK2作为头颈部肿瘤患者总生存预后生物标志物的潜在作用，但只有两项研究提出问题并得到一致的结论：HIPK2高表达与TSCC和OHSCC患者总生存率较差相关，而与RFS的关系尚不清楚[17]。Zhang等[9]观察到肿瘤细胞质HIPK2表达与乳腺癌无复发生存率较差有关。在小细胞肺癌中，HIPK2阴性肿瘤患者的RFS较高，随访较好[18]。目前，对于所有头颈部鳞状细胞癌患者，HIPK2表达与RFS的关系尚不清楚。本研究首次描述HIPK2表达与OSCC患者OS和RFS关系，将有助于明确HIPK2的生物学功能与OSCC发展之间的潜在作用。研究结果显示，HIPK2低、中表达组的中位无进展生存时间均比HIPK2高表达组显著降低，并且以高HIPK2表达组为参考，低、中HIPK2表达组5年OS和5年RFS的相对危险度均显著降低。这些结果表明，HIPK2高水平表达患者的预后比中、低水平HIPK2表达的患者更差。

总之，本研究的结果表明HIPK2蛋白表达水平可作为OSCC的独立预后标记物。HIPK2蛋白表达增加及其与OSCC预后差、淋巴结转移的相关性为其在OSCC的发生和进展中的作用提供了证据。进一步研究HIPK2与其他潜在基因或环境危险因素相互作用是十分必要的，这将有助于阐明HIPK2在OSCC发病机制中的复杂作用。