TLR4在神经炎症及其介导的神经退行性疾病中的作用①

金毅然 邵宝平 丁艳平 张晋平

(西北师范大学生命科学学院，兰州730070)

神经炎症是发生在中枢神经系统(Central nervous system，CNS)的一种炎症反应。近来研究表明神经炎症与多种神经退行性疾病如阿尔兹海默症(Alzheimer′s disease,AD)、帕金森症(Parkinson′s disease,PD)和肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)等的发生和发展有密切的关系[1]。在神经炎症发展过程中，神经细胞表达各种促炎细胞因子。Toll-like受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)是一种独特的模式识别受体(Pattern recognition receptor,PRR)，广泛存在于神经细胞中[2]。它识别并结合相应的病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PMAPs)引发机体天然免疫应答，诱导炎性反应。神经炎症引发TLR4表达水平上调，参与CNS病理生理过程[3]。 该文综述了TLR4在神经炎症中的激活和信号转导途径，阐述了TLR4与神经炎症的关系及其在神经退行性疾病中的作用机制。最后，提出抑制TLR4作为药物靶点的应用前景，为促进TLR4发展为一种新的治疗靶点提供基础资料。

1 TLR4信号通路

天然免疫通过TLRs识别病原微生物，所有的TLR都有一个Toll-白细胞介素1受体域(Toll-interleukin 1 receptor domain,TIR)负责信号转导。当TLRs识别PMAPs后，发生二聚化，进而构象改变(图1)，募集下游的接头蛋白分子。TLR4主要有两条途径：一条是髓样分化因子88 (Myeloid differentiation factor 88,MyD88)途径，另一条是MyD88非依赖途径[4]。胞外信号传递到胞内，胞内结构域TIR与MyD88的羟基端结合，同时MyD88氨基端再与IL-1受体相关激酶4(IL-1 receptor-associated kinase 4,IRAK4)结合，激活IRAKs。IRAK4磷酸化后与MyD88分离，进一步和TNF相关受体因子6(TNF receptor associated factor 6,TRAF6)相互作用。TRAF 6激活NF-κB抑制物的激酶(Inhibitor of nuclear factor kappa-B kinases,IKKs)复合体，诱导IκB(Inhibitor of nuclear factor kappa-B)磷酸化。磷酸化的IκB从复合物中分离出来，直接靶向泛素化和蛋白酶体降解，从而激活转录因子NF-κB。释放的NF-κB位于细胞核，介导多种促炎细胞因子基因的表达[5]。IKKs的信号通路激活MAPK级联导致另一个转录因子AP-1的激活。它们都在促炎细胞因子的表达中发挥重要作用[6]。

MyD88非依赖途径是由易位关联膜蛋白(Translocating chain-associated membrane protein,TRAM)启动的。依赖β干扰素TIR结构域连接蛋白(TIR domaincontaining adaptor inducing IFN-β,TRIF)被招募后，与IKKs相互作用，实现转录因子IRF3的磷酸化[7]。TRIF还能与IRAK1相互作用，激活转录因子干扰素调节因子7(Interferon regulatory factory 7,IRF7)。激活的IRFs转移到细胞核，与DNA结合，产生IFN-β等抗病毒分子[8]。TRIF还通过受体相互作用蛋白1(Receptor-interacting protein 1,RIP1)来激活MyD88非依赖的NF-κB途径。RIP1与TRIF结合，导致Fas相关的死亡域依赖性凋亡和NF-κB激活[9]。

2 TLR4在神经炎症及其介导的神经退行性疾病中的作用(见图2)

2.1TLR4与神经炎症 神经炎症过程涉及多种细胞，包括小胶质细胞(Microglia，MG)、星形胶质细胞(Astrocytes,Ast)、神经元、内皮细胞和淋巴细胞。MG是CNS的免疫细胞，在稳态下，MG监测微环境，保护Ast和神经元；在病理条件下，MG被激活形态发生改变，通过吞噬细胞碎片和改变分泌物保护神经细胞。然而，MG的过度激活会导致神经元损伤，因此MG在神经炎症中起着重要的作用[10]。TLR4是CNS感染和损伤过程中调节免疫反应的关键宿主分子。在大脑中TLR4主要在MG中表达，能被脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)特异性识别[11]。当TLR4被LPS触发后，TLR4信号通路的下游蛋白NF-κB被激活，释放炎性细胞因子。研究表明，对TLR4信号通路的抑制可减轻神经炎症，这提示TLR4的拮抗剂可以作为神经炎症一种治疗方案。从而进一步证实了TLR4及其下游信号通路在神经炎症中起关键作用。

图1 TLR4信号通路Fig.1 TLR4 signal pathway

2.2TLR4在AD中的作用 AD是一种神经退行性疾病，其病理特征包括细胞外淀粉样斑块聚集、淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein,APP)切割产物β-淀粉样蛋白(Amyloid β-protein,Aβ)Aβ1-42与Aβ1-40 (Aβ)和细胞内神经纤维缠结(Neurofibrillary tangles,NFTs)的产生[12]。AD炎症反应的特征包括MG形态改变以及Ast在衰老斑周围数量增加。

临床研究表明，Aβ和NFTs能够与各种PRRS结合，启动MG介导的炎性反应，这导致细胞活化、促进炎症因子释放和MG标记物表达增加[13]。关于AD患者死后脑组织及相关小鼠模型的研究表明，分布在老年斑周围MG上TLR4及其共受体CD14的表达水平均有所升高[14]。研究证明TLR4能被Aβ寡聚体所激活，小鼠脑内注射寡聚Aβ，通过TLR4信号诱导MG活化，并大量释放炎性因子IL-1β、IL-6 以及TNF-α[15]。TLR4体外研究显示，抗体诱导阻断TLR4抑制MG的活化与NO和IL-6的释放显著降低有关[16]。此外，在AD小鼠模型中TLR4基因突变会导致IL-1β和巨噬细胞炎性蛋白1α(Macrophage inflammatory protein-1α,MIP-1α)表达增加，并提高Aβ的聚集[17]。有文献表明TLR4的激活所呈现出的Asp299Gly多态性有利于Aβ聚集。与之相反，一种LPS衍生的脂质单磷酰脂A(Monophosphonyl lipid A,MPLA)轻度刺激可改善MG和单核细胞的吞噬功能，从而降低AD(APP/PS1)转基因小鼠Aβ的聚集[18]。这显示了TLR4在AD中的复杂性。早期结果表明，LPS诱导TLR4活化和IL-1β产生对Tau磷酸化和NFTs有不利的影响[19]，但是最近有研究显示，LPS刺激TLR4可以减少Tau磷酸化，减轻认知缺陷[20]。这些数据表明TLR4信号在AD的MG活化和神经损伤过程中发挥关键作用，提示TLRs信号通路可能是AD治疗的重要靶点。

图2 TLR4信号途径与各种神经退行性疾病之间的关系Fig.2 Relationship between TLR4 signal pathway and various neurodegenerative diseases

2.3TLR4在PD中的作用 PD是AD后第二常见的神经退行性疾病。其特征是神经元、神经纤维或神经胶质细胞中α-突触核蛋白(α-synuclein,α-SYN)的异常聚集[21]。其发生神经炎症的病理学标志为患者壳核、海马、横嗅皮质、扣带回皮质和颞叶皮质中存在活化的MG，并伴有Ast增生[22]。

活化的MG产生各种促炎因子和神经毒性因子，包括细胞因子和自由基，引发炎症的恶性循环，这可能加重PD的神经毒性。炎性细胞因子和TLR4共受体CD14作为PD的调节因子，能在多巴胺能神经元变性和α-SYN病中发挥作用[23]。研究发现在α-SYN病患者和小鼠模型中TLR4表达显著升高[24]。此外，敲除TLR4减弱了MG对α-SYN的吞噬作用，导致α-SYN积聚、多巴胺能神经元损失和运动障碍。进一步在TLR4缺陷型PD小鼠中发现，TLR4缺乏抑制黑质(Substantia nigra,SN)中多巴胺能神经元的数量[25]。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(Pyridine，1,2,3,6-tetrahydro-1-methyl-4-phenyl,MPTP)制备的小鼠 PD模型中，胶质细胞中TLR4炎症信号表达上调，多巴胺能神经元坏死。因此这种神经元损伤和小胶质细胞活化的相互作用可能是驱动进行性神经变性的关键过程之一。抗炎神经保护剂可以降低MG的激活。另外通过特异性TLR4抗体可部分阻断MPTP诱导的神经炎症，降低MG的活化，减少促炎症因子TNF-α、IL-1β的表达，从而部分缓解PD小鼠模型的行为学异常[26]。Ast在PD发病中的确切机制研究较少，动物研究表明，在疾病发生早期Ast通过促炎分子的表达来激活MG，也发挥了潜在的神经保护作用[27]。

2.4TLR4在ALS中的作用 ALS是一种持续性神经退行性疾病，其特征是脑干、脊髓和运动皮质中运动神经元选择性丢失。患有ALS的个体伴有神经自发性收缩、肌肉萎缩、反射亢进。绝大多数ALS病例是散发性的，这可能是由于基因和环境之间复杂的相互作用，只有约10%的ALS是家族性的[28]。

与AD和PD相似，ALS影响的脑区也伴随神经炎症的发生。它的特征是胶质增生、MG和Ast活化及促炎细胞因子的大量产生[29,30]。此外，在相关的脑区也可观察到浸润性淋巴细胞和巨噬细胞。在小鼠ALS模型中表达人类超氧化物歧化酶1(Superoxide dismutase 1,SOD1)G93A可观察到运动神经元丧失和神经炎症[31]。G93A能与CD14相互作用，经TLR2和TLR4信号通路诱导TNF-α、IL-1β和NO等炎症介质的产生，使用TLR2、TLR4和CD14封闭性抗体可降低MG的活化[32]。在ALS患者脊髓中检测到的细胞因子和趋化因子表达情况类似于AD和PD，并且包括IL-1β、TNF-α、CCL2和IL-6等。多种证据表明IL-1β促进ALS促炎因子表达[33]。在ALS动物模型中观察到TLR2、TLR4和CD14的升高表达;然而在患者身上却没有发现类似的情况[34]。体外研究已经证明细胞外SOD1可以诱导MG分泌炎性因子IL-1β和TNF-α的表达，并且这种效应是TLR2/4和CD14依赖性的[35]。虽然TLRs增加可能增强MG的激活，但ALS患者数据表明，这种现象一般与神经炎症相关，与疾病特异性发病机制相反。例如大规模的运动神经元变性释放ATP，其通过MG和Ast上的嘌呤受体P2X7抗体(P2X purinoceptor 7，P2X7)受体发出信号，导致炎性分子的表达，这种神经毒性反应可以通过抑制P2X7信号传导来减弱[36]。因此需要对ALS潜在免疫应答更进一步的研究。

3 TLR4作为药物靶点的作用前景

TLR4抑制剂可能有利于神经炎症的减轻。研究表明，TLR4特异性抑制剂tak-242能促进脑出血后血肿吸收并明显改善神经功能缺损。另一种新型TLR4拮抗剂异丁司特可抑制TNF-α、IL-6等促炎细胞因子的产生，并诱导CNS产生抗炎细胞因子IL-10，目前正在进行阿片依赖Ⅱ期试验[37]。此外，病毒蛋白衍生肽opn-401能抑制TLR4信号转导，但仍处于临床前的试验阶段[38]。

将TLR4信号通路作为神经退行性疾病的靶点还有许多亟待解决的问题。目前主要问题是如何在抑制神经炎症的同时保持先天免疫优势。TLR4的持续激活可能会失去天然免疫的优势并导致神经炎症，但炎性反应产生的一些细胞因子也会驱动宿主的防御机制和CNS的修复过程。因此TLR4相关拮抗剂和抑制剂的开发和应用将会进一步促进天然免疫在疾病治疗中的潜力。

4 结论

综上所述，越来越多的证据表明TLR4通过MyD88依赖性途径启动了许多促炎基因、细胞表面分子和趋化因子的表达，加重脑损伤。抑制TLR4信号是减轻神经炎症的一种很有前途的方法，而且靶向TLR4信号通路的预处理可能有效地保护CNS免受损伤。然而，直接抑制TLR4也可能不是改善神经炎症的一种有希望的治疗途径，因为TLR4的抑制可能导致天然免疫机制功能的丧失。虽然过度促炎细胞因子的产生对神经炎症有不利作用，但一些细胞因子也会驱动宿主的防御和CNS的修复过程。尽管相关研究取得了很大进展，但关于向临床应用的彻底过渡仍有许多尚未解决的问题，这些问题得到解决，才能将TLR4作为神经炎症及其诱导产生的神经退行性疾病的有价值的治疗靶点。