双亚苄基哌啶与蛋白酶体抑制剂对舌癌细胞毒性作用及机制

陈静坤，叶展超，郑晓辉，张锦雀

(1. 厦门大学附属中山医院口腔科，福建 厦门 361000；2. 厦门医学院机能与临床转化福建省高校重点实验室，福建 厦门 361023；3. 福建医科大学附属口腔医院，福建 福州 351004)

黏附调节分子1(adhesion regulating molecule 1，ADRM1)亦被称为 hRpnl3(human Rpn13)，是26S蛋白酶体亚单位19S调节颗粒上的主要泛素受体之一，决定26S蛋白酶体结构不对称性。ADRM1介导的蛋白酶体泛素化路径介导NF-κB、TGF-βI型受体、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)等底物蛋白降解[1]。研究表明[2-5]，ADRM1在结肠癌、肺癌、肾癌、肝癌等多种实体瘤和急性白血病中均处于过表达状态，下调 ADRM1蛋白表达可明显促进癌细胞凋亡。 因此，ADRM1可能成为肿瘤治疗靶点。有研究表明[2, 6-11]，双亚苄基哌啶RA190可与ADRM1的半胱氨酸88共价结合，快速触发多泛素蛋白累积，诱导对硼替佐米耐药的多发性骨髓瘤细胞凋亡，也抑制卵巢癌、肝癌、肝内胆管癌等多种肿瘤细胞增殖；也有大量研究报道蛋白酶体抑制剂MG132通过抑制泛素蛋白酶体途径活性，诱导肺癌[12]、Burkitt淋巴瘤[13]、急性髓系白血病[4]、肝癌、结直肠癌[14]等癌细胞凋亡；协同全反式维甲酸诱导GTF2I-RARA融合基因阳性的HL60细胞分化[15]。

那么，RA190与MG132在舌癌细胞中作用效果如何呢？本实验拟通过观察舌癌细胞株CAL27和TCA8113在RA190或MG132药物作用下存活率变化及周期与凋亡情况，比较这两种药物对舌癌细胞的毒性作用及作用机制，为临床治疗舌癌药物选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞株 舌癌细胞株CAL27、TCA8113为福建医科大学口腔医学院馈赠。

1.1.2试剂 MG132(Cat. No. HY-13259)结构见Fig 1、RA190(Cat. No. HY-100739)结构见Fig 2、CCK8(Cat. No. MA0218)(MCE，中国)，ADRM1(Cat. No.12019)、Cyclin B1(Cat. No.12231)、Bak(Cat. No.6947)、Bax(Cat. No. 5023)蛋白Western blot用一抗体(CST，美国)，DMEM、D-hanks、PBS(Corning，美国)，胰酶(Gibigo，美国)，胎牛血清(Cat. No.900-108，Gemini，南美)，PI(KeyGEN Biotech，中国)；Annexin V FLUOS Staining Kit(Cat. No. 11858777001，Roche，德国)。

Fig 1 Chemical structure of RA190

Fig 2 Chemical structure of MG132

1.1.3仪器 二氧化碳细胞培养箱2323-2(SHELLAB公司)；倒置显微镜37XA(上海光学仪器厂)；酶标仪(Bio-rad公司)；流式细胞仪EPICSXL(贝克曼库尔特公司)；电泳仪PowerPac HC(Bio-Rad公司)；快速Western blot仪器MA01821(Millipore)；垂直电泳槽VE-180(上海天能科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1细胞增殖/毒性实验 设(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 μmol·L-1)不同浓度RA190或MG132实验组、对照组(无药)和空白组(不含细胞)。在96孔板中接种100 μL细胞悬液(细胞浓度2×108·L-1)，于37℃、5% CO2培养箱预培养24 h；吸弃培养基，向每孔加入100 μL含不同浓度RA190或MG132的完全培养基，孵育24h；每孔加入10 μL CCK-8 ，在培养箱内孵育3 h；用酶标仪测定在450/630 nm处的吸光度。绘制曲线。

1.2.2流式细胞术检测细胞周期 6孔板中接种2 mL细胞悬液(细胞浓度5×108·L-1)，于37℃、5% CO2培养箱预培养24 h；吸弃培养基，向每孔加入2 mL含不同浓度RA190或MG132的完全培养基，孵育24h后，收集细胞于5 mL PBS中，800 r·min-1离心5 min， 弃上清，预冷的PBS洗2次，300 μL预冷的PBS重悬沉淀后，吸取700 μL预冷的无水乙醇逐滴滴入重悬液中，置-20℃固定过夜，之后按PI说明书操作。

1.2.3Annexin V FLUOS Staining Kit流式细胞术检测细胞凋亡 用Annexin V FLUOS Staining Kit检测细胞凋亡率。细胞加药及收集步骤同“1.2.2”，之后按说明书操作。

1.2.4Western blot检测细胞内蛋白表达 细胞加药培养步骤同“1.2.2”，收集各组细胞，PBS洗2次，加入RIPA细胞裂解液(含1 mmol·L-1PMSF、1 mmol·L-1正钒酸钠、10 mg·L-1抑肽酶)提取总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度，取40 μg总蛋白进行Western blot实验。10% SDS-PAGE电泳后，行转膜印迹，分别用β-actin、ADRM1、Cyclin B1、Bax、Bak一抗体与膜上的抗原结合，然后用HRP偶联的二抗与其反应，用ECL化学发光试剂检测，经压片曝光后，显影和定影。比较各组蛋白表达情况。设2个复孔，不同时间独立重复3次。

2 结果

2.1 RA190或MG132对舌癌细胞存活率的影响以细胞浓度2×108·L-1种板，CCK-8法酶标仪检测RA190或MG132 (0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 μmol·L-1)作用24 h后舌癌细胞CAL27、TCA8113的OD450/630值。设3个复孔，不同时间独立重复3次。如Fig 3所示，随着MG132浓度提高，CAL27、TCA8113细胞活力下降，半抑制浓度IC50分别约为0.1和0.3 μmol·L-1；其中，当MG132浓度在0.2～1.6 μmol·L-1期间TCA8113细胞活力曲线处在平缓阶段，说明这期间MG132对TCA8113细胞毒性作用变化不大。RA190对CAL27、TCA8113细胞的IC50分别约为0.18和1.6 μmol·L-1；RA190浓度在0.2～0.8 μmol·L-1期间CAL27细胞活力曲线平缓，在0.8 μmol·L-1之后活力曲线处于平台阶段，说明部分CAL27细胞对RA190耐药；RA190浓度为0.8 μmol·L-1左右TCA8113细胞活力才开始下降，说明RA190需要在较大的浓度下才对TCA8113细胞产生毒性作用。

Fig 3 Cell viability of CAL27 and TCA8113 cells treated with different RA190 or MG132 concentrations for 24 h

2.2 RA190、MG132对舌癌细胞周期作用细胞以5×108·L-1接种6孔板2 mL，设0.5、1 μmol·L-1RA190或MG132实验组和对照组，各组2个复孔，流式细胞术检测各组细胞周期变化，独立重复实验3次。如Fig 4、Tab 1所示，0.5、1 μmol·L-1RA190(R0.5， R1)均诱导CAL27细胞G1/G0期停滞，对TCA8113周期无影响；1 μmol·L-1RA190也诱导CAL27细胞G2/M期停滞；0.5、1 μmol·L-1MG132(M0.5，M1)均诱导CAL27细胞G2/M期停滞，对TCA8113周期无影响。

Fig 4 Cycle of CAL27 and TCA8113 cells treated with different concentrations of RA190 or MG132 for 24 h n=3)

2.3 RA190、MG132对舌癌细胞凋亡影响细胞以5×108·L-1接种6孔板2 mL，设0.5、1 μmol·L-1RA190或MG132实验组和对照组，各组2个复孔，流式细胞术检测各组细胞凋亡，独立重复实验2次。如Fig 5、Tab 2所示，在0.3、0.5、1 μmol·L-1MG132作用下，CAL27与TCA8113细胞早期与晚期凋亡率均提高(P<0.05)，并与剂量呈线性关系；0.5、1 μmol·L-1RA190均对CAL27凋亡无影响，1 μmol·L-1RA190提高TCA8113细胞早期与晚期凋亡率[(4±1)%，(5.97±0.86)%；P<0.05)]。

Fig 5 Apoptosis of TCA8113 cells treated with 1 μmol·L-1 RA190 or MG132 for 24 n=3)

2.4 RA190、MG132对舌癌细胞内ADRM1、Cyclin B1、Bax、Bak蛋白表达的影响为探讨RA190与MG132对舌癌细胞的毒性作用与ADRM1的相关性及两药作用机制差异性，本实验采用Western blot检测 0.5、1 、2 μmol·L-1RA190或MG132(R0.5，R1，R2；M0.5，M1，M2)作用24 h后，舌癌细胞内ADRM1、Cyclin B1、Bax、Bak蛋白表达变化。如Fig 6所示，TCA8113细胞内ADRM1蛋白水平显著低于CAL27细胞(P<0.05)；随着RA190或MG132药物浓度提高，Cyclin B1蛋白表达上调(P<0.05)，ADRM1、Bax、Bak蛋白表达下调(P<0.05)；TCA8113细胞在1 μmol·L-1RA190作用下ADRM1、Bak、Cyclin B1蛋白表达差异不大，而在相同浓度MG132作用下，Bax表达下调、Cyclin B1表达上调。

Tab 1 Cycle of CAL27 and TCA8113 cells treated with different concentrations of RA190 or MG132 for 24 h n=3)

Tab 2 Apoptosis of CAL27 and TCA8113 cells treated with different concentrations of RA190 or MG132 for 24 h n=3)

Fig 6 Expression of ADRM1, Cyclin B1, Bax and Bak protein in CAL27 and TCA8113 cells treated with different concentrations of RA190 or MG132 for 24 h n=3)

3 讨论

实验中，本课题组发现，TCA8113细胞种板24 h后，有大量悬浮细胞，这些细胞经台盼蓝染色观察，活率达75%；吸取悬浮细胞种板，大量细胞仍可贴壁。因此，药物对舌癌细胞的毒性观察应包含这部分悬浮细胞。综合Fig3～5结果：①RA190组：RA190引起CAL27细胞活力下降，对CAL27细胞凋亡无作用，提示RA190可能主要通过阻滞CAL27细胞于G0/G1或G2/M期引起细胞活力下降；相反，RA190对TCA8113周期无显著影响，但在0.8 μmol·L-1之后通过促凋亡作用对TCA8113细胞产生毒性作用；RA190作用下舌癌细胞活力曲线中间部分较为平缓，可能是贴壁细胞对RA190较不敏感。这提示RA190在舌癌中作用具有很大的选择性和局限性。② MG132组： MG132诱导CAL27细胞G2/M期停滞，对TCA8113细胞无影响；MG132明显提高CAL27与TCA8113细胞早期与晚期凋亡率，说明MG132主要通过促进细胞凋亡引起舌癌细胞活力下降；MG132可影响CAL27周期和凋亡，这导致MG132对CAL27细胞毒性作用强于TCA8113细胞。

在哺乳动物细胞中，Cyclin B从G1期晚期开始表达并逐渐积累，到G2期后期阶段达到最大值并一直维持到M期的中期阶段，然后迅速降解。CAL27细胞在RA190或MG132作用下G2期阻滞，此时细胞内Cyclin B1蛋白表达上调，两者结果一致。

Bak、Bax是人体重要促凋亡分子，下调Bax、Bak蛋白表达，可能抑制细胞凋亡，从而提高细胞存活率。但本实验中MG132明显促进CAL27细胞凋亡，此时Bax、Bak蛋白表达减少，两者存在矛盾。这可能是MG132促CAL27细胞凋亡时，细胞内存在负反馈调节；也可能提示MG132对CAL27细胞促凋亡作用存在其他机制，具体有待进一步研究。这为后续实验提供新思考。

MG132与RA190明显下调CAL27内ADRM1蛋白表达，但RA190对该细胞凋亡无明显作用，提示ADRM1不是影响舌癌发生发展的癌基因。同时，RA190下调CAL27内ADRM1蛋白表达，与其浓度呈线性关系，而MG132则不存在这种线性关系，这说明ADRM1介导的蛋白酶体泛素化路径不是MG132在舌癌细胞中的主要作用途径；MG132在舌癌中存在其他重要作用通路，具体有待进一步研究。另外，MG132明显促进CAL27细胞凋亡，具有明显毒性作用，可能用于舌癌治疗，但由于其作用靶点不单一，因此可能存在较多的副作用。

综上，本研究认为靶向ADRM1药物RA190仅适用于ADRM1高表达舌癌治疗，但其IC50浓度相对MG132较高，用于舌癌治疗可能并不理想；本研究同时也为舌癌临床采用蛋白酶体抑制剂策略奠定基础。