增龄对大鼠睾丸自噬水平和血睾屏障完整性的影响

尤 旭，赵海霞，马琼艳，杨思琪，张 艳，杨 圆，叶 勇，袁 丁，张长城

(三峡大学医学院，湖北 宜昌 443002)

随着社会经济的发展、生活环境的变化和人们生育观念的改变，选择晚育的夫妇越来越多。然而，随着年龄的不断增加，男性睾丸组织结构和功能会出现不同程度的衰退，生精功能逐渐下降，精子数量和质量均明显下降，精子形态发生异常，男性不育和子代畸形率也大幅上升。研究显示[1-2]，睾丸血睾屏障完整性被破坏是导致衰老睾丸生精功能衰退的重要因素，而睾丸自噬功能受损又是导致血睾屏障完整性被破坏的重要原因[3]。然而，衰老过程中睾丸自噬水平是否发生变化及如何变化，尚无相关文献报道。本研究探讨了衰老过程中睾丸自噬水平的变化及其对血睾屏障完整性的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级♂Sprague-Dawley(SD)大鼠，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCX K(京)2012-0001，分笼饲养于三峡大学实验动物中心，室温(23±3)℃，湿度(60±5)%，12 h阴暗交替，自由摄食和饮水。

1.2 主要材料与试剂β-actin抗体(货号#4970)和β-catenin抗体(货号#8814)，购自Cell Signaling Technology公司；ATG5抗体(货号10181-2-AP)和LC3抗体(货号14600-1-AP)，购自Proteintech公司；ATG7抗体(货号500691)，购自正能抗体公司；Beclin1抗体(货号ab207612)，购自Abcam公司；Occludin抗体(货号sc-5562)，购自Santa Cruz公司；羊抗鼠、羊抗兔和兔抗羊二抗及牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，购自武汉科瑞有限公司；Alexa Fluor 488驴抗兔 IgG(H+L)抗体，购自Jackson ImmunoResearch公司；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)，购自Life Technologies公司；BCA蛋白定量试剂盒，购自北京普利莱基因技术有限公司；BeyoECL Plus超敏ECL化学发光试剂盒，购自碧云天生物技术研究所；高蛋白脱脂高钙奶粉，购自内蒙古伊利实业集团股份有限公司。

1.3 主要仪器LEICA TP 1020全自动脱水机和ULTRACUT R超薄切片机购于德国Leica公司；摊片烤片机购于上海寰熙医疗器械有限公司；BX53显微镜购于日本Olympus公司；A1R+激光共聚焦显微镜购于日本Nikon公司；JA2003电子分析天平购于上海天平仪器厂；电动匀浆器购于常州德杜精密仪器有限公司；CT15RT高速冷冻离心机购于上海天美生化仪器设备工程有限公司；PK-600S水浴锅购于上海精宏实验设备有限公司；51118650酶标仪购于美国Thermo公司；PowerPacTMBasic电泳仪和Mini PROTEAN3 Cell电泳槽购于美国Bio-Rad公司；Bioshine ChemiQ4800 mini化学发光凝胶成像显影设备购于上海欧翔科学仪器有限公司。

1.4 方法

1.4.1动物分组与处理 分别购买不同月龄的♂SD大鼠，即6月龄、12月龄、18月龄和24月龄，每个月龄组大鼠各10只，称取大鼠体重，腹腔注射20%乌来糖麻醉后处死，迅速取出两侧睾丸组织，称重，右侧睾丸组织迅速过液氮，储存于-80 ℃超低温冰箱中备用，左侧睾丸放于4%多聚甲醛中固定。

1.4.2HE染色观察大鼠睾丸组织形态学的变化 将睾丸取出，4%多聚甲醛中固定24～48 h后，常规梯度乙醇脱水、二甲苯处理、石蜡包埋、切片，按常规操作进行苏木精和伊红染色，中性树脂封片。光学显微镜下观察睾丸形态和结构的变化，每张切片随机观察5个视野，并拍照取图。

1.4.3Western blot检测大鼠睾丸组织Beclin1、ATG5、ATG7 、LC3Ⅱ、Occludin和β-catenin蛋白的表达水平 精密称取30～40 mg新鲜睾丸组织，按照1 ∶20(质量 ∶体积)加入含磷酸化蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，使用电动匀浆器低温匀浆40 s后，于冰上裂解1 h，期间每10 min涡旋一次。随后，4 ℃条件下12 000 r·min-1离心10 min，取上清，采用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白浓度测定。在上清中按照4 ∶1加入上样缓冲液，95 ℃加热10 min灭活。每孔等量蛋白上样，SDS-PAGE凝胶电泳并恒流转PVDF膜。5%脱脂牛奶封闭1 h后，一抗4 ℃孵育过夜。TBST洗3次，每次5 min。随后，二抗室温孵育1 h，最后ECL化学发光法显影。各组实验均重复3次。

1.4.4免疫荧光法观察大鼠睾丸组织Beclin1、LC3和β-catenin蛋白的表达及定位 取睾丸石蜡切片置于60 ℃烘箱烤片至蜡熔，二甲苯脱蜡与梯度乙醇脱水脱蜡，用柠檬酸修复液高压修复抗原10～15 min。待冷却至室温后，5% BSA封闭1 h，孵育一抗，4 ℃孵育15 h左右。二抗37 ℃孵育60～90 min后，DAPI染色10 min，最后抗荧光淬灭剂封片，4 ℃避光保存。在激光共聚焦显微镜下进行观察，每张切片随机观察5个视野并拍照取图。各组实验各重复3次。

2 结果

2.1 增龄过程中大鼠睾丸组织形态学的变化HE染色显示，6月龄组大鼠睾丸组织生精小管形态结构完整，管内可见排列整齐的各级生精细胞；12月龄时，大鼠睾丸组织中部分生精小管形态结构开始出现一定程度的退化；18月龄时，睾丸组织形态进一步变差，上皮变薄，生精细胞层数减少，小管界膜增厚；24月龄组大鼠睾丸部分生精小管发生严重萎缩，小管中生精细胞缺失，结果见Fig 1。

2.2 增龄过程中大鼠睾丸血睾屏障相关蛋白β-catenin和Occludin表达水平的变化采用免疫荧光和Western blot法检测了血睾屏障相关蛋白β-catenin表达水平的变化，结果如Fig 2和Fig 3所示，增龄过程中，大鼠睾丸组织中β-catenin 蛋白表达逐渐降低，且主要分布于生精小管管腔周围。此外，随着年龄增加，大鼠睾丸血睾屏障另一重要细胞连接蛋白Occludin表达水平也逐渐下降。以上结果提示，大鼠睾丸血睾屏障完整性随增龄而逐渐被破坏。

Fig 1 Morphological changes of testicular tissues in rats of different age groups

Fig 2 Expression and localization of β-catenin in testicular tissues in rats of different age groups

Fig 3 Expression levels of blood testis-associated protein β-catenin and Occludin in testicular tissues in rats of different age groups n=6)

2.3 增龄过程中大鼠睾丸自噬相关蛋白Beclin1、ATG5、ATG7和LC3Ⅱ表达水平的变化Beclin1、ATG5、ATG7和LC3Ⅱ是自噬过程中的几个关键蛋白，可用于评价细胞内自噬功能的强弱。Western blot结果显示，增龄过程中，大鼠睾丸组织中Beclin1、ATG5、ATG7和LC3Ⅱ蛋白表达水平逐渐下降，结果见Fig 4。

Fig 4 Changes of Beclin1, ATG5, ATG7 and LC3Ⅱ protein expression levels in testicular tissues in rats of different age groups n=6)

2.4 增龄过程中大鼠睾丸组织Beclin1和LC3蛋白表达及定位免疫荧光结果显示，增龄过程中，大鼠睾丸组织中自噬标志蛋白Beclin1 和LC3 表达水平逐渐降低，且主要表达于睾丸生精小管上皮细胞中，结果见Fig 5。

Fig 5 Expression and localization of Beclin1 and LC3 in testicular tissues in rats of different age groups (×400)

3 讨论

衰老是器官功能和个体机能随时间推移而发生退化的一个极其复杂和多因子的过程[4]。伴随着机体老化、性腺结构和功能的退化是人类衰老的主要特征之一。睾丸是男性生殖系统的重要器官，具有合成、分泌雄激素和产生精子的能力。大量研究显示[5-6]，衰老睾丸生精小管形态结构发生明显改变，如出现萎缩、生精细胞层数明显减少和各级细胞排列疏松等。本研究也显示，增龄过程中，大鼠睾丸组织形态逐渐发生改变，生精小管发生萎缩，生精细胞层数减少，细胞间间隙增大，且发生部分脱落现象，与文献报道基本一致，提示增龄过程中大鼠睾丸生精功能逐渐发生减退。

最新研究显示[1-2]，血睾屏障的完整性被破坏是衰老睾丸生精功能减退的重要原因。Levy等[1]报道，老年大鼠睾丸血睾屏障相关超微结构发生明显变化，血睾屏障被破坏，睾丸精子生成减少。Catriona等进一步发现，随着大鼠年龄的增长，参与形成血睾屏障的相关细胞连接的蛋白表达减少，进而导致血睾屏障保护生殖细胞的能力下降[2]。睾丸中非信号的β-catenin作为黏附连接的adaptor蛋白，外接细胞连接的膜蛋白，内接细胞骨架纤维F-actin，是血睾屏障建立的一个不可缺少的连接蛋白[7]。β-catenin也是血睾屏障的特异性蛋白，有文献也将其视为血睾屏障的蛋白标志物[8]。Occludin是生精上皮中支持细胞间形成紧密连接结构的基础，其程序性的开启与关闭保证了精子发生正常进行，若异常开放则会影响精子发生的正常进程。有文献报道，干扰睾丸支持细胞内Occludin蛋白的功能状态，会导致不育[9]。本研究显示，增龄过程中大鼠睾丸中参与形成血睾屏障的相关细胞连接蛋白β-catenin和Occludin表达逐渐下降，提示增龄过程中大鼠睾丸血睾屏障的完整性逐渐被破坏，与现有文献报道一致。

近期研究显示，睾丸血睾屏障结构与功能的维持与睾丸中自噬水平密切相关。睾丸中的自噬对于维持精子发生的血睾屏障的形成以及某些成分的降解至关重要[10]。睾丸自噬功能受损可使构成血睾屏障的相关细胞连接蛋白(如Occludin)等下调，破坏血睾屏障的完整性，进而导致精子数量明显减少，精子畸形率增加，生育能力明显下降[3]。自噬过程中，LC3-Ⅱ和Beclin1 蛋白的表达强度与自噬活性密切相关，被认为是自噬体的标志分子[11]。ATG5 在自噬泡形成过程中起重要作用，可诱导自噬体的形成[12]。ATG7在自噬体和囊泡的形成过程中发挥重要作用，是激活细胞自噬必不可少的基因[13]，且对于精子发生的正常进行至关重要[14]。有研究显示，小鼠睾丸支持细胞中ATG5或ATG7被特异性敲除后，睾丸生精小管结构紊乱，血睾屏障完整性受损，精子头部畸形且活力低下、小鼠不育[15]。本研究显示，增龄过程中大鼠睾丸自噬相关蛋白Beclin1、ATG5、ATG7和LC3Ⅱ表达水平均出现下降，提示增龄过程中大鼠睾丸自噬水平逐渐下降。

综上所述，增龄过程中大鼠睾丸生精功能减退，其机制与睾丸生精小管上皮细胞自噬水平下降，进而破坏血睾屏障的完整性，导致生精微环境改变有关。本实验有助于更好地理解自噬在衰老睾丸生精功能衰退中的作用。

(致谢：本实验完成于三峡大学医学院国家中医药管理局中药药理科研三级实验室。感谢医学院实验中心和肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室对本课题提供的支持与帮助，感谢本课题组全体老师和同学对实验的帮助！)