再造烟叶循环白水中细菌检测方法的确立

王洪涛，吴 茜，刘肖肖，吴帅霖，陈 旭，李若雨，陈 云，李世朋

(河南大学 生命科学学院，河南 开封 475004)

伴随生态文明建设的推进，提高水资源利用率已成为困扰造纸企业的一大难题.造纸法再造烟叶(Reconstituted Tobacco)的生产，沿用了造纸行业中相关的工序，生产过程水耗比较高.为了提高再造烟叶生产过程中资源的利用率，生产过程中的白水通常循环使用[1].随着再造烟叶生产白水的循环使用，烟叶中可溶解的成分持续溶解于白水中，白水中营养物质不断富集，易导致白水产生异味、多粘性物质的聚集、纸机出现断纸的次数增加、生产效能的降低，甚至会影响产品的感官品质下降.

在造成白水中烟叶残渣增多、水质偏酸、氧化电位高的同时，有机污染物也容易引发微生物滋生，导致BOD(生物需氧量)和COD(化学需氧量)的含量增高[2-3]，不但降低了薄片的品质，也降低了生产的效能.尽管有一些报道对白水的利用做了大量的研究工作，但大多都还没有大面积推广和应用[4-5]，还需要做更深入和细致的工作.为了降低水耗、清洁生产、稳定产品质量和改善生产环境，亟需对白水中的细菌数量、变化规律和种类进行一系列的深入研究.因此，如何较为准确地测定出白水中细菌的含量，就成为开展进一步工作必须面对的首要问题.

本文综合分析文献资料，对常用的几种检测细菌的方法进行初步的筛选和对比分析，结果显示：浊度法、重量法和美兰染色直接计数法检测时间短，操作简单，但由于易受到干扰物质影响，一般适用于细菌的纯培养体系；国标采用的平板菌落计数法，其测定结果准确性高，但只能检测可培养的活细菌，且检测时间较长；荧光法中的ATP荧光细菌计数法可检测到各种来源的ATP，当有污染(有机物或微生物)并非均匀地分布在产品接触表面等情况时，无法区分不同来源的ATP而受到限制[6]；荧光法中的吖啶橙显微计数法是利用吖啶橙(Acridine Orange, AO)作为荧光染料，其激发波长488 nm，发射光波长为515 nm，具有膜通透性，能够穿透细胞膜与细胞中的DNA和RNA结合，从而发出不同荧光，能够同时检测活细菌和衰亡细菌，操作简便，检测快速[7].本研究的目的是探索并优化适用于白水细菌总数的检测方法.

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

材料：烟草薄片公司生产线网下工段同一地点的循环白水(RTCW)，每隔5 min取样一次，连续取5个样品.

试剂：牛肉膏(北京奥博兴生物技术有限责任公司)、蛋白胨(北京奥博兴生物技术有限责任公司)、琼脂(北京索莱宝科技有限公司)、氯化钠(北京索莱宝科技有限公司)、吖啶橙(Amresco 0360)、亚甲基蓝(天津市科密欧化学试剂有限公司)、聚乙烯吡咯烷酮(北京化学试剂有限公司)、甲醛(浓度为38%，天津市科密欧化学试剂有限公司)、香柏油(中国上海懿阳仪器有限公司)，试剂均为分析纯.

实验所用水均为三蒸水，并经过醋酸纤维素滤膜过滤，高压蒸汽121 ℃灭菌20 min后所得.

仪器：冰箱、分析天平、超净工作台、恒温培养箱、高速分散器、高压高温灭菌器、精密天平、移液枪、生化培养箱、电热鼓风干燥箱、智能恒温振荡器、荧光显微镜、漩涡振荡器、醋酸纤维素滤膜、黑色碳酸脂滤膜、一次性注射器.

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配制

0.2% 吖啶橙：分析天平称取0.2 g吖啶橙粉末，精确至0.01 g，无菌水溶解，定容至100 mL.

1% 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)：分析天平称取1 g聚乙烯吡咯烷酮粉末，精确至0.01 g，无菌水溶解，定容至100 mL.

牛肉膏蛋白胨固体培养基(BEPSM)：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，琼脂粉15 g，用蒸馏水溶解，用5 mol/L的氢氧化钠调节至pH为7.0，定容至1 000 mL，高压蒸汽121 ℃灭菌20 min.

吕氏碱性美蓝染液：A液：亚甲基蓝0.6 g，95%酒精30 mL；B液：KOH 0.01 g，蒸馏水100 mL；A液和B液混合.

1.2.2 平板菌落计数法[8]

参考国标GB 4789.2-2010 菌落总数测定法测定.根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的.取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，计算活菌数.

1.2.3 浊度法[9]

参考文献的方法，选择最大吸收波长为600 nm光吸收的数值.比浊法是根据细菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量.细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表示样品菌液浓度.

1.2.4 重量法

此法分为湿重法和干重法.湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重；干重法系单位体积培养物经离心后，以清水洗净放入干燥器加热烘干，使之失去水分然后称重.

1.2.5 美兰染色直接计数法[10]

参考文献的方法，将白水样品中的细菌固定到载玻片上，进行美兰染色，脱色制片，在白光下使用100倍油镜观察计数.

1.2.6 吖啶橙染色直接计数法[7]

参考文献的方法，对样品预处理、固定、显色和计数.吖啶橙溶液要求现配现用，并要求无菌滤器反复过滤至过滤无压力为止.

2 结果与讨论

2.1 白水中细菌检测结果

2.1.1 常见测定方法使用范围的比较

几种常见细菌测定方法的情况对比，见表1.

表1 几种常见的细菌检测方法对比

由表1可以看出，基于待测样品自身特点，筛选适合于白水中细菌的检测方法，吖啶橙荧光显微计数法可以满足检测的要求.基于ATP荧光检测法测定的是ATP的存在量，对于组成复杂的白水体系，产生和消耗ATP的成分都比较复杂，干扰因素太多，故未列在表内.

2.1.2 浊度法与重量法的测定结果

依据浊度法、重量法测定白水中细菌数量的结果见表2.

表2 浊度法与重量法检测结果

如表所示，采用浊度法、重量法检测白水中细菌数值的重现性均较差.分析其主要原因是，在再造烟叶白水中含有大量的细小纤维和碳酸钙[11]，这些辅料在600 nm的特定波长有较大的光吸收，会对测定细菌的吸光值(浊度法)产生较大影响，而这些细小纤维和碳酸钙又难以进行有效的分离，这些物质在离心过程中随着细菌一起被分离出来(重量法)，从而对检测结果造成较大的干扰.由此可见，以测定细菌总数为目的的白水系统，微细纤维和生产辅料的混溶物严重干扰了细菌总数的测定，浊度法和重量法均不适合作为再造烟叶生产用白水细菌总数的测定方法.

2.1.3 美兰染色显微计数法的测定结果

白水样品中细菌的美兰染色显微效果，如图1所示.

(a)为白水中细菌显微效果图; (b)为单个染色点放大效果图图1 美兰染色显微图Fig.1 Effect picture of methylene blue staining microscopic

结果表明，用美兰染色显微计数法无法进行准确计数.主要原因可能是，美兰染色时，染色的特异性不是很强[12]，白水中的可溶性物质、固体颗粒、纤维状物质都可能吸附美兰染料，从而形成片状染色结果，对细菌计数造成较大干扰.因此，美兰染色显微计数法也不适合用于准确的测定白水中细菌的数量.

2.1.4 国标平板菌落计数法(FCCM)与吖啶橙染色直接计数法(AODC)的测定结果

取在冰箱存放1、38、58 d的白水以合适比例稀释后，分别进行国标平板菌落计数法涂板和吖啶橙染色直接计数法染色，涂板和吖啶橙染色效果如图2所示，放置时间分别为：(a) 1 d；(b) 38 d；(c) 58 d；(d) 1 d；(e) 38 d；(f) 58 d.

图2 白水腐败过程中菌落数与细菌总数的变化Fig.2 Variations of CFU and total bacterium during RTCW decaying

国标平板菌落计数法的检测结果显示，白水存放1、38和58 d时，菌落数分别为2.38×108、1.40×107和3.40×106个/mL(图2a、b、c).检测出的细菌数值随着白水放置时间的延长，细菌数量在逐渐降低，这与白水放置期间细菌逐渐死亡，所剩活细胞逐渐减少呈现较好的对应关系.但38和58 d时白水逐渐腐臭，表明国标平板菌落计数法检测的活菌总数无法真实地反映再造烟叶白水的质量指标，因而呈现表象乐观的检测结果.

有研究者指出，由于高浓度的营养基质、无法实现原位培养、不明确环境中微生物之间的相互作用、缺乏尖端的微生物检测方法等原因的影响，尽管微生物培养技术已经发展了几十年，但是环境中可培养的微生物比例仍然较低[13].景晓敏也发现，在用平板菌落计数法对生长、繁殖及死亡的动态微生物计数时，检测结果不是很敏感[14].

吖啶橙染色直接计数法的结果表明，白水存放1、38和58 d时，细菌总数分别为1.57×109、6.47×109和8.40×109个/mL(图2d、e、f).检测出的细菌总数随着白水腐败程度加重而增加，能对白水腐败程度起到重要的表征作用.这主要是由于吖啶橙与细胞中的核酸结合呈现橙红色或绿色荧光，不易受细胞形态的影响[15]，可同时检测出活菌和衰亡细菌，因而能够比较真实地反映再造烟叶白水真实的细菌数量变化.

2.2 AODC检测方法的优化

上述的测定结果表明，吖啶橙染色直接计数法适合再造烟叶生产用白水细菌总数的检测.为了更好的指导生产，本实验对该检测方法进行了优化.

2.2.1 甲醛固定时间的优化

如图3所示，甲醛固定的时间分别为: (a) 0.5 min；(b) 1 min；(c) 2 min；(d) 3 min；(e) 5 min.

图3 甲醛固定时间优化图Fig.3 Study of formalin fixation time

通过图3可以看出，甲醛固定时间为2 min时可以满足检测需求. 5 min后细菌衰亡弥散，影响检测.检测方法最终选定甲醛固定时间为2 min.

2.2.2 吖啶橙染色时间优化

如图4所示，吖啶橙染色的时间分别为：(a) 5 min，(b) 10 min，(c) 15 min，(d) 20 min，(e) 25 min.

从图4可以看出，吖啶橙荧光染色时间较短时，显色反应不明显，染色>15 min，能在显微镜下观察到比较清晰的荧光染色图像，适合计数，因此，确定吖啶橙荧光染色的时间为15 min.

图4 吖啶橙染色时间优化图Fig.4 Study of acridine orange staining time

2.3 AODC检测方法的确定

白水是一个成分比较复杂的系统，它主要含有：无机盐(碳酸钙、氯化钠等)、可溶性糖、蛋白质、纤维素(可溶性、微晶和短小纤维素)等.其中短小纤维素对光吸收的干扰较大，使光吸收的数据不稳定，而不能作为判断指标应用于生产过程的检测.另外，白水在循环使用过程中，其成分和含量在不断的变化，光吸收数据不稳定，增加了用固定的光吸收数据来定量描述的难度.因此，用浊度法、重量法和美兰染色直接计数法测定白水中细菌总数时干扰的因素较多，致使这些测定细菌数量的方法产生较大的偏差而不能使用，给准确测定白水系统中细菌数量的工作增加了难度.由于白水中可培养的微生物比例仍然较低[13]，平板菌落计数法的测定也受到了限制[14].对于荧光显色的ATP荧光检测法[16]来说，因为它只适合于无任何其他来源ATP体系中细菌的检测，在卫生监控中纯粹以检测微生物数量为目的来进行ATP测试的做法是不可取的[6].吖啶橙荧光显微计数法避免了白水体系中复杂成分的干扰，较好地表征出了白水中细菌数量的变化，表征细菌数量的特异性比较强.

为了便于研究白水系统中细菌总数的变化规律，为生产和监控等提供重要的依据，因此选定适于白水中细菌总数的测定方法是吖啶橙荧光显微计数法，并经过对反应条件的优化，确定具体操作的步骤如下：

在超净工作台无菌的环境下，均匀混合待测样品，吸取待测样品1 mL在无菌的试管中，加入无菌水9 mL充分混匀后.按照同样的操作，将该混合液选择适当的梯度进行进一步的稀释.在显微镜下观察，以每个视野中显示20～200个细菌为最佳的稀释比例.

取稀释后的待测样品适量于试管中，首先加入38%甲醛(控制终浓度约2.0%)，混匀反应时间为2 min.再加入1%吖啶橙染色液(终浓度约0.01%)振荡1 min混匀，染色反应时间为15 min.用黑色碳酸脂滤膜过滤，并用无菌水清洗后再过滤，重复洗涤过滤操作三次.以10 mL无菌水代替样品进行同样操作作为空白对照.

取下滤膜置于滴有香柏油的载玻片上，滴香柏油少许，放置盖玻片，完成制片.

放置制片于油镜下观察，调整激发光在450～490 nm的范围内计数，在合适的视野范围内，选取大于15个视野分别计数，最后取其算术平均值为样品的测定值.

统计测定结果，按以下公式代入计算，得到样品中细菌总数的测定值.

N=K*Ns*S/(So*V)

其中：N:测定样品的细菌总数，个/mL；

K：待测样品的稀释倍数；

Ns：视野中细菌的平均数，个；

S：过滤网膜面积，μm2；

So：观察视野的面积，μm2；

V：过滤样品量，mL.

综上所述，吖啶橙染色直接计数法适应于白水中细菌数量的测定.该方法的确定，为深入和细致的研究白水中细菌数量及其变化规律等一系列工作提供了有利的条件.

3 结论

1) 适应于白水中细菌数量的测定方法是吖啶橙染色直接计数法，该测定方法耗时时间短，且特异性较好.

2) 吖啶橙染色直接计数法不仅可以测定繁殖能力强的细菌，还可以测定衰亡的细菌，适应范围更广泛.

3) 该课题的进一步研究可以为控制白水中细菌总数提供重要依据，对于食品安全的预警和生产安全指标的调节和控制都具有深远的意义.