转基因玉米2A-5特异性PCR方法的建立

武文艳, 刘新香, 周秒依, 刘金香, 刘亚

北京市农林科学院玉米研究中心, 玉米DNA指纹及分子育种北京市重点实验室, 北京 100097

根据国际农业生物技术应用服务组织(The International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications，ISAAA)统计，2018年种植或进口转基因作物的国家和地区共计70个，全球转基因作物种植面积达到1.9亿hm2。自1996年以来，转基因作物种植面积累计达25亿hm2，约增加了113倍，堪称全球普及速度最快的作物技术[1]。玉米是用途最为广泛的粮食作物，同时也是全球种植范围最广、产量最大的谷类作物，2018年全球转基因作物种植面积的30.7%为转基因玉米，转基因玉米种植面积高达到5 890万hm2，从全球单一作物的种植面积看，2018年转基因玉米的应用率为30%[1]。

随着各国对转基因产品阈值管理和标识制度的相继建立实施，对转基因产品进行定量检测成为必然趋势，越来越多的检测技术被应用于转基因产品的定量检测。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术因其实时、快速、高效和准确定量的优点，已经广泛被应用于转基因产品定量检测[2]。目前已经商业化的转基因玉米品种NK603、MON88017、MIR162等均已建立了品系特异定量PCR检测方法[3-5]。微滴式数字PCR(ddPCR)技术是一种对核酸分子进行绝对定量的方法，该方法在传统PCR扩增前对样品进行微滴化处理，每个微滴不含或含有一个至数个待检测的核酸靶分子，在PCR扩增后，对每个微滴逐个进行检测，根据泊松分布原理，计算出核酸靶分子的起始拷贝数或浓度，从而实现绝对定量的目的。相比于实时荧光PCR，数字PCR具有更好的测量独立性，且数字PCR无需任何校准物，具有更高的稳定性、特异性、灵敏度和精确性等优点[6]。

利用ddPCR技术可以实现对转基因玉米、水稻植株的基因拷贝数检测分析，相比于传统的Southern blot，ddPCR技术分析更为简便、快速[7-8]。Fu等[9]通过运用ddPCR技术，对转基因作物的通用元件CaMV35s启动子和NOS终止子进行定量检测，特异性验证了MON810、MON863等9种转基因品系，该方法的检测限为0.1%，低于欧盟规定的标识阈值水平，表明该方法的灵敏度高、特异性好，可对转基因成分含量进行精确定量检测。周圆等[10]运用数字PCR技术，建立了基于TC1507、MIR162、MIR604 3种转基因玉米品系的二重微滴式数字PCR(ddPCR)检测方法，研究表明该方法的灵敏度高且特异性强，可应用于进出口农产品中这3种转基因玉米品系成分的定量检测。

转基因玉米2A-5是中国农业大学研发的具有抗玉米螟虫的转化体，含有3个外源基因(mCry1Ab、mCry2Ab和bar)表达盒，目前仍缺乏特异性定性及定量检测方法。本研究的目的是根据转基因玉米2A-5的旁侧序列，设计合成ddPCR反应的引物和探针，优化反应条件和反应体系，建立转基因玉米2A-5及其衍生品种的特异性定性定量的检测方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

转基因玉米2A-5纯合种子样品由中国农业大学提供，作为阴性对照的非转基因玉米样品由本实验室保存。

1.2 主要试剂及仪器设备

DNA提取试剂盒购自北京康为世纪有限公司；Premix ExTaq(Probe qPCR)实时荧光PCR试剂盒均购自TaKaRa宝日医生物技术(北京)有限公司；引物及探针由北京擎科生物技术有限公司合成；荧光PCR仪选用ABI Q5(美国ABI 公司)；数字PCR仪选用 QX200 Droplet Digital PCR系统(美国Bio-Rad公司)；分光光度计选用Nanodrop 1000分光光度计(美国Nanodrop公司)。

1.3 DNA提取

转基因玉米2A-5种子发芽后，用DNA试剂盒(CWBio)提取试验材料的DNA，提取样品的浓度用Nanodrop 1000分光光度计测定。

1.4 引物设计及最佳引物组合的筛选

运用Primer Premier 5.0在外源插入序列及左右边界侧翼序列分别设计单向引物，扩增产物的长度范围为100～300 bp，共设计18个引物探针组合，其中5′端11对，3′端7对(表1)。以2A-5基因组为模板进行扩增，筛选特异性强、灵敏度高、扩增稳定的引物探针组合。进行引物探针筛选，根据结果选择扩增信号最强、Ct值最小的引物探针组合作为候选。

表1 实时荧光PCR检测候选引物信息表Table1 The informations of real-time PCR candidate primers

1.5 实时荧光PCR方法

反应体系：2A-5 PCR反应体系(20 μL)：10 μL Premix ExTaq(Probe qPCR)、0.8 μL 2A-5-5-QF8(10 μmol·L-1)、0.8 μL 2A-5-5-QR8(10 μmol·L-1)、0.4 μL 2A-5-5-QP8(10 μmol·L-1)、0.4 μL ROX Reference Dye、2 μL的DNA模板、5.6 μL无核酸酶水，ddH2O补足混匀。玉米内参基因zSSⅡb反应体系除引物探针外与2A-5 PCR反应体系相同，zSSⅡb-QF：5′-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3′，zSSⅡb-QR：5′-AAAGGGCCAGGTTCATTATCC-TC-3′，zSSⅡb-QP：5′-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-3′。将混匀后的PCR管放在离心机上，500～3 000 g离心10 s，然后取出PCR管，放入PCR仪中，运行实时荧光PCR扩增。

PCR扩增反应程序：95 ℃变性5 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸60 s,40个循环；在第二阶段的退火延伸(60 ℃)时段收集荧光信号。每个试样PCR扩增设置3次平行。

标准曲线制作：将2A-5基因组DNA做2倍梯度稀释分别为80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625和0.313 ng·μL-1，用于qRT-PCR标准曲线的绘制。分别以内参基因zSSⅡb和2A-5特异性序列引物及探针进行实时定量PCR反应，每个梯度设置3个平行重复，拷贝数的自然对数值作为横坐标，Ct值(荧光信号达到设定阈值时的循环次数)作为纵坐标，绘制内参基因和2A-5特异性序列标准曲线，并求解回归方程。

根据Ct值与zSSⅡb基因含量和2A-5特异序列的不同含量，绘制Ct值与zSSⅡb基因含量、2A-5特异序列的扩增标准曲线，分别计算出2A-5样品中内源参考基因zSSⅡb和2A-5特异序列片段的绝对含量，再根据以下公式计算出样品中2A-5目标基因的相对含量=(外源基因拷贝数/内源参考基因拷贝数)×100%。

1.6 数字PCR方法

数字PCR反应体系：10 μL ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)、0.7 μL 2A-5-5-QF8(10 μmol·L-1)、0.7 μL 2A-5-5-QR8(10 μmol·L-1)、0.25 μL 2A-5-5-QP8(10 μmol·L-1)、0.7 μLzSSⅡb-QF(10 μmol·L-1)、0.7 μLzSSⅡb-QR(10 μmol·L-1)、0.25 μLzSSⅡb-QP(10 μmol·L-1)、1 μL DNA模板、5.7 μL无核酸酶水，混匀。

微滴生成：将含有样品的20 μL ddPCR预混液与70 μL微滴生成油加入微滴发生卡，覆盖专用胶垫后放入微滴生成仪生成40 μL微滴，然后将微滴转移至PCR扩增板内，将PCR扩增板放入PCR仪中，运行PCR扩增。

扩增反应程序：95 ℃变性8 min，变速温度(Ramp)2 ℃·s-1；进行40次循环扩增反应(94 ℃变性30 s，Ramp 2 ℃·s-1；60 ℃退火延伸40 s，Ramp 2 ℃·s-1)；98 ℃延伸10 min，Ramp 2 ℃·s-1；4 ℃保存。

信号读取：扩增结束后，将PCR板放入微滴读取仪中进行信号读取，并运用QuantaSoft进行试验数据分析，获得绝对定量结果。

测试样品的转基因品系百分含量=转基因植物外源基因拷贝数/转基因植物内源参考基因拷贝数×100%。

2 结果与分析

2.1 2A-5荧光PCR检测体系建立

根据转基因玉米2A-5的外源插入序列以及自由边界的侧翼序列，共设计18个引物探针组合。针对PCR扩增结果，选择重现性最好、灵敏度最高、扩增条带最亮的引物探针组合。经过筛选，2A-5-5-QF8、2A-5-5-QR8、2A-5-5-QP8扩增效果较为理想。

2.2 2A-5 PCR检测方法的试验验证

2.2.1特异性检测 以1%的2A-5转基因玉米作为阳性对照，利用之前优化好的PCR扩增体系和反应程序检测其他转基因玉米Bt11、Bt176、MON810、MON863、MON87460、MON88017、MON89034、MIR162、NK603、T25、TC1507、59122、MIR604样品和非转基因玉米样品。检测结果表明，仅从2A-5转基因玉米样品中得到扩增曲线，而在其他样品中均未得到特异扩增曲线，扩增结果如图1所示，表明建立的2A-5转基因玉米检测方法具有高度特异性。

图1 实时荧光PCR检测方法特异性测试Fig.1 The specificity test of real-time PCR

2.2.2灵敏度测试 设置9个2A-5 DNA含量梯度分别为500、250、50、10、2、0.4、0.08、0.025和0.005 ng·μL-1的DNA样品，进行荧光PCR扩增。结果显示，在含量为0.025 ng·μL-1的样品中能扩增到预期DNA片段(图2A)。

2.2.3检出限的确定 选定0.025 ng·μL-1DNA含量进行检出限测试，50次反应全部出现扩增曲线(图2B)，平均Ct值为36.3。因此可以确定实时荧光PCR方法的绝对检出限为样品DNA含量0.025 ng·μL-1，相对检出限为0.05%。

图2 实时荧光PCR检测方法灵敏度测试和检出限测试Fig.2 The sensitivity test and detection limit test of real-time PCR

2.3 2A-5定量PCR检测方法的建立

2.3.1实时荧光PCR定量检测 将转基因玉米2A-5基因组提取液与非转基因玉米基因组提取液按一定倍数稀释成为以下转基因含量的DNA溶液：100%、50%、25%、10%、5%、1%、0.5%、0.25%、0.1%、0.05%、0.01%，作为qRT-PCR定量检测的试验样品。

本试验建立的标准曲线，如图3所示，两条标准曲线斜率相近，扩增效率良好，2A-5外源基因及内源参考基因的扩增效率分别为91.4%和94.3%，误差值在可接受范围之内，回归方程的相关系数均达到0.99以上，说明试验建立的qRT-PCR标准曲线内源参考基因与外源基因扩增效率较高，完全适合用作2A-5外源基因和内源参考基因zSSⅡb定量检测标准曲线。

A： 2A-5的标准曲线：Y=28.587-3.547X，相关系数=0.995，效率=91.4%，误差值=0.025；B：zSSⅡb的标准曲线：Y=29.471-3.467X，相关系数=0.996，效率=94.3%，误差值=0.034。

由扩增曲线及2A-5目标基因相对含量公式得出qRT-PCR检测转基因成分含量见表2。该结果表明qRT-PCR检测转基因成分含量与2A-5样品转基因成分含量呈高度正相关，能反映出样品中转基因分子的含量水平。

表2 qRT-PCR试验检测2A-5转基因成分含量Table2 The content of transgenic components of 2A-5 gene detected by qRT-PCR

2.3.2微滴数字PCR定量检测 将qRT-PCR定量检测的试验样品稀释10倍作为ddPCR检测的DNA样品(ddPCR要求DNA含量不超过10 ng·μL-1)。ddPCR的关键步骤是微滴生成，只有微滴数大于10 000时，DNA分子的分布才符合泊松分布的统计学原理，系统才能对阳性和阴性微滴进行计数。本试验中反应中形成的微滴数均大于10 000，满足ddPCR微滴的分析要求，结果见表3。PCR反应模板量与测定样品拷贝数之间相关系数达到97.5%，呈显著正相关。该结果表明微滴数字PCR定量检测方法能得到扩增的含转基因成分的最低百分含量为0.05%，检测底限平均达4个阳性拷贝数，且能较好的反映样品中转基因分子的含量水平，具有较高的灵敏度和准确度。

表3 ddPCR试验检测2A-5转基因成分含量Table3 The content of transgenic components of 2A-5 gene detected by ddPCR

3 讨论

对跨玉米自身基因和外源基因的序列区域进行引物和探针的设计，不仅可以达到品系鉴定的目的，并且在对含有多组分加工产品进行检测时，也可以确定所检出的外源基因是否来自于玉米，从而达到品系和品种同时鉴定的目的[11]。本研究研发的转基因玉米2A-5特异性荧光定量PCR检测方法筛选出最佳引物探针组合2A-5-5-QF8、2A-5-5-QR8、A-5-5-QP8,扩增结果显示出特异性强、灵敏度高和重复性好等特点，初步建立了检测转基因玉米2A-5转化体特异性定量PCR方法。

目前全球已有多个国家和地区对转基因生物及其产品制定了相关的法律和法规，要求对其实行标识管理。例如欧盟、巴西分别规定转基因成分超过0.9%、1%时必须进行标识；日本规定对大豆或玉米制成的食品如豆腐、玉米小食品等必须含有转基因标识，其标识阈值设定为5%；我国实行的标识管理政策为定性按目录强制的标识制度，即凡是列入目录的产品，只要含有转基因成分或者是由转基因作物加工而成的产品必须进行标识[12]。标识制度不断发展和完善促使转基因检测方法从定性检测到定量检测推进，快速、灵敏、准确的定量检测技术已经成为转基因生物及其产品检测方法研究的重点，是安全管理和标识法规实施过程中的技术支撑[13]。

目前在转基因定量检测过程中，以核酸为模板基础的检测技术qRT-PCR与ddPCR等成为定量转基因成分检测的首选技术，本文研究了这两种技术在2A-5定量检测中的应用。实时荧光定量PCR通过在PCR过程中实时监测荧光信号累积的变化，从而推断出模板的初始量，根据不同梯度含量的样品可绘制出荧光扩增的标准曲线。在定量PCR检测中，理想的扩增效率为100%，然而在实际检测中由于探针的设计、所用试剂和仪器不同、操作手法等原因限制，PCR很难实现100%的扩增效率，通常扩增效率在90%～110%之间，回归系数在0.99以上，便可获得较为可靠的定量结果[5]。本研究中利用qRT-PCR技术绘制出了2A-5转化体特异序列及内源参考基因的标准曲线，计算出2A-5转化体特异序列及zSSⅡb基因的初始模板拷贝数及2A-5转化体的百分含量，与预混样品2A-5转化体转基因含量比较，相关性达到0.99以上，达到极显著水平，能够较好的反映样品中转基因分子的含量水平。

ddPCR与实时荧光定量PCR使用的引物和探针相同，可以对样品做绝对定量分析。基于微滴式数字PCR平台，潘广等[14]建立了一种同时测定样品同一个微滴反应体系中两种靶序列的双重微滴式数字PCR的定量方法，对该方法的灵敏度研究表明，当相对标准偏差≤25%时，利用该方法建立的T25双重数字PCR方法可检测到4.6个拷贝的T25特异性边界序列，当不考虑相对标准偏差时可检测到该边界序列分子的1个拷贝。本研究中通过ddPCR方法能得到扩增的含转基因成分的最低百分含量为0.05%，检测底限达平均4个阳性拷贝数，可以满足国际上对转基因食品1%检测底限的要求，检测准确度和灵敏度均相对较高。

目前，被欧盟等国际组织认可的转基因成分定量分析方法是以Taqman探针为主的实时荧光PCR技术，但是荧光定量PCR技术是一种相对定量方法，需要建立标准曲线，且建立标准曲线的过程中涉及体系的摸索和优化以保证扩增效率符合要求，对转基因产品进行定量的结果易受影响[15]。相对于实时荧光定量PCR，利用ddPCR进行定量检测PCR不依赖于Ct值，不受扩增效率影响，检测速度快，稳定性、灵敏度和精确性高[16]。ddPCR技术减少了实际检测中标准曲线对测量结果产生影响等问题，降低了基体效应，实现了PCR扩增的样品分离，消除了本底信号对结果产生的影响，提高了低拷贝DNA的扩增灵敏度[17-18]。

本研究研发的引物和探针组合可以准确鉴定出利用2A-5以及作为亲本转育出的衍生品种，同时利用qRT-PCR、ddPCR方法建立了2A-5的定量检测方法，本研究建立的该玉米品系定量方法特异性强，稳定性好，灵敏度、精确性以及准确性高，既适用于我国转基因生物安全管理，又可以进一步对我国转基因产品检测标准体系进行完善。