碳纳米管固定化纤维素酶的最佳工艺研究

李丽娟, 夏文静, 马贵平

1.乌兰察布医学高等专科学校, 内蒙古 乌兰察布 012000;

2.南京师范大学泰州学院, 江苏 泰州 225300

纤维素酶是用于降解纤维素的一类复合酶，主要由内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶以及β-葡萄糖苷酶组成，但由于纤维素酶的生产成本较高,生物活性较低，使得纤维素酶的应用受到了局限[1]。固定化酶技术是用固定化材料将酶束缚或限制在一定区域内，仍能进行催化反应并可以重复利用[2]，能很好地解决纤维素酶活性低、实际工作中用量大、且不可回收利用、生产成本高等问题。

目前，用于固定化酶的纳米材料有碳纳米管[3]、纳米多孔金[4]、纳米多孔铜[5]、氧化石墨烯[6]等，其中碳纳米管具有极好的化学稳定性、良好的生物相容性、良好的分散性[7-8]，同时具有较大的比表面积[9]和较高的载酶量[10]，且既容易制备又价格低廉[7]，在固定化酶的应用中最有发展前景。用于固定化酶的碳纳米管主要是多壁碳纳米管和单壁碳纳米管两种[11]，单壁碳纳米管仅由一层石墨片围绕中心轴卷曲而成，而多壁碳纳米管由许多石墨片围绕着中心轴卷曲形成，相比于单壁碳纳米管，多壁碳纳米管可以负载更多的酶[12]，因此，应用更为广泛。由于多壁碳纳米管表面疏水，所以有必要在固定化酶之前进行功能化[13]，功能化的多壁碳纳米管可以改变碳纳米管表面的疏水性结构，在其表面创造了一些结合位点，这些丰富的结合位点为酶的吸附和嵌入提供了机会，创造了酶更适合的微环境[14]。已报道的多壁碳纳米管固定化酶，易于从反应体系中分离，可重复使用，大多较游离酶具有较高的热稳定性和较宽的pH范围[15]。

为获得更好的固定化效果，本文应用多壁碳纳米管固定化纤维素酶，从酶的浓度、固定化时间、温度、pH等方面进行了固定化条件优化，同时，通过红外光谱分析了多壁碳纳米管、纤维素酶及固定化酶的化学组成，以期为纤维素酶的生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

绿色木霉纤维素酶购自上海瑞永生物科技有限公司，10 U·mg-1。多壁碳纳米管购自深圳纳米港有限公司，外径15～30 nm，长1.5 μm。

1.2 多壁碳纳米管的功能化

将0.1 g的多壁碳纳米管和100 mL硝酸和硫酸的混酸溶液(体积比为1∶3)，放入容积为200 mL的三角瓶中,之后将其放入超声波清洗器中超声4 h(40 ℃，40 kHz)，待充分冷却使多壁碳纳米管沉淀后，去上清，用蒸馏水进行分散，通过4 000 r·min-1离心去上清，反复操作6～7次，洗到pH接近中性为止, 在80 ℃真空干燥48 h，冷却干燥24 h，获得功能化的多壁碳纳米管[16]。

1.3 不同pH的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液配制

将10.5 g柠檬酸·H2O加蒸馏水溶解，之后定容至1 000 mL，即为50 mmol·L-1柠檬酸；将8.95 g Na2HPO4·12 H2O加蒸馏水溶解，之后定容至1 000 mL，即为50 mmol·L-1Na2HPO4，将50 mmol·L-1柠檬酸和50 mmol·L-1Na2HPO4按不同比例混合，通过pH计测定，配制不同pH为50 mmol·L-1柠檬酸-Na2HPO4缓冲液。

1.4 多壁碳纳米固定化管酶

通过物理吸附法固定纤维素酶到功能化的多壁碳纳米管上，将4 mg的多壁碳纳米管，分别加入到5 mL不同浓度的纤维素酶溶液中，将上述溶液在30 ℃，200 r·min-1的水浴箱中孵化3 h，3 800 r·min-1离心12 min后，小心移去上清液，重新分散到50 mmol·L-1柠檬酸-Na2HPO4缓冲液当中清洗酶与碳纳米管的复合物至少4～5次，移去未结合的酶，将复合物在空气中干燥24 h，获得多壁碳纳米管固定化纤维素酶[17]。

1.5 纤维素酶活的测定

以羧甲基纤维素(CMC)为底物，采用DNS法测定[18]。取50 mmol·L-1pH 4.8的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液1.0 mL和1%的CMC 0.5 mL，加入到25 mL刻度试管中，并加入0.5 mL适当稀释的酶液，在50 ℃水浴箱中反应30 min，然后加入3 mL的DNS煮沸5 min，冷却后加蒸馏水定容至25 mL，混匀后在540 nm条件下比色测定。(空白对照以0.5 mL蒸馏水代替酶液)。 固定化纤维素酶酶活的测定，是将游离酶酶活测定中的0.5 mL适当稀释的酶液，用0.5 mL蒸馏水和一定质量的固定化酶来代替，其余步骤同游离酶酶活的测定相同。设定3组平行实验，1组空白对照，以3组实验数据的平均值作图。

1.6 酶的固定率测定

测定固定化过程中加入游离酶的总活力M0，以及固定化后上清液中酶的总活力M1，固定率=(M0-M1)/M0×100%

1.7 纤维素酶的热稳定性研究

将固定化酶和游离酶分别置于60 ℃的恒温水浴箱中，每隔5 min取样，待其冷却至室温测定酶活，初始酶活力为100%，计算酶活力随时间变化的趋势，以时间为横坐标，相对酶活力为纵坐标作图。

1.8 纤维素酶的pH稳定性研究

将固定化酶和游离酶分别加入pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的50 mmol·L-1柠檬酸-Na2HPO4缓冲液，4 ℃放置1 h，初始的酶活力为100%，计算酶活力随时间变化的趋势，以pH为横坐标，相对酶活力为纵坐标作图。

1.9 功能化的多壁碳纳米管、纤维素酶和固定化酶的特征

通过傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)表征功能化多壁碳纳米管、纤维素酶和固定化酶的化学组成特点，采用溴化钾压片，在4 000～400 cm-1频率范围记录红外光谱特征[19]。

2 结果与分析

2.1 功能化的多壁碳纳米管固定化酶的条件优化

2.1.1酶浓度对固定化酶活力及回收率的影响

在30 ℃、pH 7.0的条件下，分别加入不同浓度的纤维素酶溶液，图1显示，当酶浓度达到4 mg·mL-1时，酶的固定率最高，继续增加酶的浓度，酶的固定率逐步下降，也意味着酶的损失率逐步增加。因此4 mg·mL-1的酶浓度作为最优条件为下一步的研究使用。

图1 酶浓度对固定化酶活力及固定率的影响Fig.1 Effect of enzyme concentration on the activity of immobilized cellulase and efficiency of immobilization

2.1.2固定化时间对固定化酶活力的影响 在30 ℃、pH 7.0、酶浓度4 mg·mL-1的条件下，研究固定化时间对固定化酶活力的影响，从图2可以看出，固定化时间在1～3 h时，固定化酶活力逐渐增加，但超过3 h，固定化酶的活力增加不明显。所以固定化时间选择为3 h。

图2 固定化时间对固定化酶活力的影响Fig.2 Effects of immobilization time on the activity of immobilized cellulase

2.1.3温度对固定化酶活力的影响 从图3可以看出，温度在40 ℃的时候，固定化酶活力较高，酶活力达35.30 U·g-1，所以固定化酶的温度选择40 ℃。

图3 温度对固定化酶活力的影响Fig.3 Effects of temperature on the activity of immobilized cellulase

2.1.4pH对固定化酶活力的影响 在40 ℃、酶浓度4 mg·mL-1、固定化3 h的条件下，研究不同pH对固定化酶活力的影响。图4可以看出，pH 5.0的时候，固定化酶活力最高，选择固定化纤维素酶的最适pH为5.0。

图4 pH对固定化酶活力的影响Fig.4 Effect of pH on the activity of immobilized cellulase

2.1.5固定化酶制备条件的优化 通过单因素试验研究了酶浓度、温度、pH和固定化时间4个因素对固定化酶活力的影响，固定化时间大于3 h时，酶活力变化不大，所以选取其他3因素的较优水平，按L9(34)正交表设计试验，确定固定化纤维素酶的最佳工艺条件。表1表明，条件5中的固定化纤维素酶的活力最高，达37.44 U·g-1，由此可见，固定化纤维素酶的最佳工艺条件为：酶浓度5 mg·mL-1，温度40 ℃，pH 5.0，按照极差大小排列各因素的主次顺序为：温度>酶浓度>pH。

表1 正交试验因素水平表Table1 Factor levels of orthogonal experimental

2.2 纤维素酶的热稳定性

将固定化酶和游离酶置于60 ℃水浴箱中，间隔不同时间取样测定酶活力，图5表明，游离酶在水浴中放置20 min，酶活力仅剩初始酶活力的49.59%，而固定化酶放置60 min，酶活力保持原酶活力的90%以上，放置120 min，酶活力仍保持原酶活力的70%以上，说明酶固定化后，热稳定性增加。这可能是由于纤维素酶被固定化到功能化的碳纳米管的孔径当中，整体是一个块状结构，因此能很好的防止酶在高温中失去活力[20]。

图5 固定化酶和游离酶的热稳定性Fig.5 Thermal stability of immobilized and free enzymes

2.3 纤维素酶的pH稳定性研究

图6显示，固定化酶和游离酶在pH 2.0～3.0范围内最稳定，随着pH的增加，酶的稳定性逐步下降，但固定化酶下降的幅度较游离酶小，说明固定化酶的pH稳定性有所提高，相似的结果在其他研究中也有报道[21]。

图6 固定化酶和游离酶的pH稳定性Fig.6 pH stability of immobilized and free enzymes

2.4 功能化的多壁碳纳米管、纤维素酶和固定化酶的FT-IR分析

通过FT-IR光谱图比较功能化多壁碳纳米管、纤维素酶和固定化酶的化学组成，如图7中a曲线看出：功能化的多壁碳纳米管在1 631 cm-1出现C=C伸缩振动，表明功能化后的多壁碳纳米管仍然保持着碳纳米管的石墨结构；1 720 cm-1峰值暗示着羧基基团的C=O伸缩振动，这是由于酸处理使得碳纳米管被羧化所出现的峰值；通过cvd方法制备的多壁碳纳米管还包含着3 400 cm-1的-OH伸缩振动，1 375 cm-1和1 450 cm-1的C-H弯曲振动。图7中b曲线显示纤维素酶在2 910 cm-1出现了N-H伸缩振动，1 522 cm-1出现了N-H弯曲振动，同时还出现了1 633 cm-1的C=0伸缩振动，1 029 cm-1的C-O伸缩振动，以及1 375 cm-1和1 450 cm-1的C-H弯曲振动。图7中c曲线表明， 2 860 cm-1和2 920 cm-1出现了N-H伸缩振动，证实了纤维素酶的存在，另外，1 521 cm-1的N-N弯曲振动峰值的出现，进一步证实了纤维素酶成功固定到了多壁碳纳米管的表面。

注：a—功能化的多壁碳纳米管；b—纤维素酶；c—固定化纤维素酶

3 讨论

本文应用酸处理获得了功能化的多壁碳纳米管，通过物理吸附法固定化纤维素酶，为固定化纤维素酶提供了一种新的方法。通过FT-IR看出，纤维素酶成功地固定到功能化的多壁碳纳米管上，固定化纤维素酶的过程对碳纳米管和纤维素酶的结构没有明显的破坏。随着酶浓度的增加，固定化纤维素酶的活力逐渐增加,这是因为多壁碳纳米管表面有大量的孔径可以吸附纤维素酶，当酶浓度达到4 mg·mL-1时，碳纳米管表面的孔径大部分被覆盖，因此进一步增加酶浓度，固定化酶活力增加不明显。固定化时间是碳纳米管与纤维素酶混合液在水浴中的反应时间，固定化时间超过3 h，固定化酶的活力增加不明显，说明水浴3 h可以使纤维素酶最大限度的吸附到多壁碳纳米管上。温度对酶的活力有着双重的影响，低温的条件下，酶的活力降低，高温的条件下，酶蛋白变性，酶活力降低甚至丧失。固定化纤维素酶的最适温度为40 ℃，随着温度的升高，固定化酶的活力逐渐降低，这是由于温度升高，使得酶的空间结构发生了改变，进而影响到了酶的活性中心，使得酶的活性降低。由于pH可以影响到蛋白质的解离和带电荷的情况，因此pH对酶活力同样有着非常重要的影响。图4可以看出，固定化酶的最适pH为5.0，当pH大于7.0的时候，蛋白质处于强碱性的环境条件下，纤维素酶表面的离子基团由于强静电排斥力的作用，导致酶活性中心发生了改变，使得纤维素酶活力降低的较多。通过对固定化酶及游离酶的热稳定性进行研究，结果表明功能化的多壁碳纳米管固定化纤维素酶较游离酶具有较高的热稳定性。通过对固定化酶及游离酶的pH稳定性进行研究，表明功能化的多壁碳纳米管固定化纤维素酶的pH稳定性有所提高。

本课题组将对功能化的多壁碳纳米管固定化纤维素酶的酶学性质及重复酶解进行深入研究，通过固定化纤维素酶多轮重复使用，降低纤维素酶的使用量，进而降低成本，为酶在工业上的应用提供依据。